Initial development of DNAextractio

Initial development of DNA
extraction techniques
Friedrich Miescher was the first scientist to isolate DNA
while studying the chemical composition of cells. In 1869, he
used leukocytes that he collected from the samples on fresh
surgical bandages and conducted experiments to purify and
classify proteins contained in these cells. During his experiments
he identified a novel substance in the nuclei, which
he called “nuclein”.2
He then developed two protocols to
separate cells’ nuclei from cytoplasm and to isolate this novel
compound, nowadays known as DNA, which differed from
proteins and other cellular substances. This scientific finding,
along with the isolation protocols used, was published in
1871 in collaboration with his mentor, Felix Hoppe-Seyler.2,3
However, it was only in 1958 that Meselson and Stahl3,4
developed a routine laboratory procedure for DNA extraction.
They performed DNA extraction from bacterial samples of
Escherichia coli using a salt density gradient centrifugation
protocol. Since then, DNA extraction techniques have been
adapted to perform extractions on many different types of
biological sources.
DNA extraction methods follow some common procedures
aimed to achieve effective disruption of cells, denaturation
of nucleoprotein complexes, inactivation of nucleases
and other enzymes, removal of biological and chemical
contaminants, and finally DNA precipitation.5
Most of them
follow similar basic steps and include the use of organic and
nonorganic reagents and centrifugation methods. Finally,
they have developed into a variety of automated procedures
and commercially available kits.1,5–7
Initially, we will discuss protocols and steps aimed to
achieve cell lysis, inactivation of cellular enzymes, denaturation
of cellular complexes, and DNA precipitation, which
require similar procedures and/or reagents during DNA
extraction from whole blood samples. Key differences in
steps aiming to remove biological and chemical contaminants
will be highlighted when we discuss each protocol
in detail.
As previously mentioned, lysis of cells is a common step in
most DNA extraction protocols, and it is commonly achieved
through the use of detergents and enzymes. Sodium dodecyl
sulfate (SDS) and Triton™ X-100 (Sigma-Aldrich, St Louis,
MO, USA) are examples of popular detergents used to solubilize
cell membranes. Enzymes are also combined with detergents
to target cell surface or cytosolic components. Proteinase K is a
commonly used enzyme used in various protocols to cleave glycoproteins
and inactivate RNases and DNases. Other denaturants
such as urea, guanidinium salts, and chemical chaotropes have also been used to disrupt cells and inactivate cellular enzymes,
but these can impact on quality and nucleic acid yield.1,7–9
DNA precipitation is achieved by adding high concentrations
of salt to DNA-containing solutions, as cations from salts
such as ammonium acetate counteract repulsion caused by the
negative charge of the phosphate backbone. A mixture of DNA
and salts in the presence of solvents like ethanol (final concentrations
of 70%–80%) or isopropanol (final concentrations of
40%–50%) causes nucleic acids to precipitate. Some protocols
include washing steps with 70% ethanol to remove excess salt
from DNA. Finally, nucleic acids are resuspended in water
or TE buffer (10 mM Tris, 1 mM ethylenediaminetetraacetic
acid [EDTA]).7–9 TE buffer is commonly used for long-term
DNA storage because it prevents it from being damaged by
nucleases, inadequate pH, heavy metals, and oxidation by free
radicals. Tris provides a safe pH of 7–8, and EDTA chelates
divalent ions used in nuclease activity and counteracts oxidative
damage from heavy metals.9
Main types of DNA extraction
methods from human whole
blood samples
Table 1 shows the main categories and subcategories of
DNA extraction methods from whole blood samples that are
generally used in research facilities worldwide. Laboratory
reagents commonly used for each stage of the nucleic acid
extraction protocol are included in this table in order to
highlight similarities and differences between them.
DNA extraction techniques included in Table 1 will be
discussed in more detail in the following sections, along with
a brief summary of the technique history and background. In
recent years, some of these protocols have been adapted to
microdevices that develop miniaturized total chemical analysis
systems or microfluidic genetic analysis microchips.7,10
However, we will limit the scope of our review to those
techniques that are available for macroscale nucleic acid
extraction.
Solution-based DNA extraction methods
As previously mentioned, solution-based protocols have two
main approaches: 1) solution-based methods using organic
solvents and 2) those based on a salting out technique. Further
description of both methods follows.
Solution-based DNA extraction
methods using organic solvents
DNA extraction protocols using org

Kết quả (Việt) 1:

Phát triển ban đầu của DNAkỹ thuật khai thácFriedrich Miescher là nhà khoa học đầu tiên để tách biệt các DNAtrong khi nghiên cứu thành phần hóa học của tế bào. Năm 1869, ôngsử dụng các leukocytes ông thu thập được từ các mẫu trên tươiBăng phẫu thuật và tiến hành thí nghiệm để làm sạch vàphân loại protein có trong các tế bào. Trong thí nghiệm của ôngông xác định một chất tiểu thuyết trong hạt nhân, màông gọi là "nuclein".2 Ông sau đó đã phát triển hai giao thức đểriêng biệt của tế bào hạt nhân từ tế bào chất và cô lập cuốn tiểu thuyết nàyhợp chất, hiện nay được gọi là DNA, khác biệt so vớiprotein và các chất tế bào khác. Này phát hiện khoa học,cùng với sự cô lập các giao thức được sử dụng, đã được công bốnăm 1871 trong hợp tác với người thầy của mình, Felix Hoppe-Seyler.2,3Tuy nhiên, nó đã là chỉ năm 1958 mà Meselson và Stahl3, 4phát triển một thủ tục phòng thí nghiệm thông thường nhất khai thác DNA.Họ thực hiện khai thác DNA từ vi khuẩn mẫuBằng cách sử dụng một số muối mật độ gradient Escherichia coligiao thức. Kể từ đó, ADN khai thác kỹ thuật đãphù hợp với thực hiện nhổ trên nhiều loại khác nhauCác nguồn sinh học.Phương pháp khai thác DNA theo một số thủ tục phổ biếnnhằm mục đích đạt được hiệu quả gián đoạn của các tế bào, denaturationtrong nucleoprotein, ngừng hoạt động của nucleasesvà các enzym, loại bỏ các sinh học và hóa chấtchất gây ô nhiễm, và cuối cùng là DNA precipitation.5 Hầu hết họlàm theo các bước cơ bản tương tự và bao gồm sử dụng hữu cơ vànonorganic thử và phương pháp số. Cuối cùng,họ đã phát triển thành một loạt các quy trình tự độngvà thương mại có sẵn kits.1,5–7Ban đầu, chúng tôi sẽ thảo luận về các giao thức và các bước nhằm mục đíchđạt được tế bào lysis, ngừng hoạt động của các enzym di động, denaturationkhu phức hợp di động, và DNA mưa, màyêu cầu tương tự như thủ tục và/hoặc thuốc thử trong DNAkhai thác từ các mẫu máu toàn bộ. Các khác biệt quan trọng trongbước nhằm loại bỏ các chất gây ô nhiễm sinh học và hóa họcsẽ được đánh dấu khi chúng tôi thảo luận về mỗi giao thứcchi tiết.Như đã đề cập đến lysis của tế bào là một bước tiến phổ biến trongHầu hết các giao thức chiết DNA, và nó thường đạt đượcbằng cách sử dụng chất tẩy rửa và các enzym. Natri dodecylsulfat (SDS) và Triton™ X-100 (Sigma-Aldrich, St Louis,MO, Hoa Kỳ) là những ví dụ phổ biến các chất tẩy rửa được sử dụng để solubilizemàng tế bào. Enzyme cũng được kết hợp với chất tẩy rửamục tiêu di động trên bề mặt hoặc cytosolic thành phần. Proteinase K là mộtthường được sử dụng men tiêu hóa được sử dụng trong các giao thức để cleave glycoproteinvà hủy kích hoạt RNases và DNases. Denaturants khácchẳng hạn như urê, guanidinium muối và hóa học chaotropes cũng được sử dụng để phá vỡ các tế bào và hủy kích hoạt tế bào men,nhưng chúng có thể tác động đến chất lượng và axit nucleic yield.1,7–9DNA mưa là đạt được bằng cách thêm nồng độ caomuối có chứa ADN giải pháp, như cation từ muốichẳng hạn như amoni axetat chống lại đẩy gây ra bởi cácphí tiêu cực của xương sống phosphate. Một hỗn hợp của DNAvà sự hiện diện của các dung môi như ethanol (cuối cùng nồng độ muối của nótừ 70%-80%) hoặc isopropanol (cuối cùng nồng độ40%-50%) gây ra các axit nucleic kết tủa. Một số giao thứcbao gồm rửa bước với 70% ethanol để loại bỏ dư thừa muốitừ DNA. Cuối cùng, các axit nucleic được resuspended trong nướchoặc TE đệm 10 mM (Tris, 1 mM ethylenediaminetetraaceticacid [EDTA]).7 – 9 TE đệm thường được sử dụng cho lâu dàiDNA lí vì nó ngăn nó bị hư hại donucleases, không đủ độ pH, kim loại nặng và quá trình oxy hóa bởi miễn phígốc tự do. Tris cung cấp an toàn pH của 7-8, và EDTA chelateCác ion tương sử dụng trong hoạt động nuclease và chống lại oxy hóathiệt hại từ nặng metals.9Chính các loại ADN khai thácCác phương pháp từ nguyên của con ngườimẫu máuBảng 1 cho thấy các chính thể loại và tiểu thể loại củaPhương pháp khai thác DNA từ mẫu máu toàn bộthường được sử dụng trong các cơ sở nghiên cứu trên toàn thế giới. Phòng thí nghiệmthuốc thử thường được sử dụng cho từng giai đoạn của các axit nucleicgiao thức khai thác được bao gồm trong bảng này đểlàm nổi bật sự tương đồng và khác biệt giữa chúng.Kỹ thuật chiết DNA được bao gồm trong bảng 1 sẽthảo luận chi tiết hơn trong các phần sau đây, cùng vớimột bản tóm tắt ngắn gọn về lịch sử kỹ thuật và nền. Ởnăm gần đây, một số trong những giao thức này đã được thích nghi đểmicrodevices phát triển miniaturized tất cả các phân tích hóa họcHệ thống hoặc microfluidic phân tích di truyền microchips.7,10Tuy nhiên, chúng tôi sẽ giới hạn phạm vi của chúng tôi xem xét để những ngườikỹ thuật có sẵn cho macroscale axit nucleickhai thác.Giải pháp dựa trên phương pháp khai thác DNANhư đã đề cập, giải pháp dựa trên giao thức có haiphương pháp tiếp cận chính: 1) phương pháp dựa trên giải pháp bằng cách sử dụng hữu cơdung môi và 2) những người dựa trên một ướp muối ra kỹ thuật. Xem thêmMô tả về cả hai phương pháp sau.Dựa trên giải pháp khai thác DNAphương pháp sử dụng dung môi hữu cơGiao thức chiết DNA bằng cách sử dụng org

Kết quả (Việt) 2:

Phát triển ban đầu của DNA
kỹ thuật chiết xuất
Friedrich Miescher là nhà khoa học đầu tiên để cô lập DNA
trong khi nghiên cứu thành phần hóa học của tế bào. Năm 1869, ông
đã sử dụng bạch cầu mà ông thu thập được từ các mẫu trên tươi
băng phẫu thuật và tiến hành các thí nghiệm để làm sạch và
phân loại protein chứa trong các tế bào. Trong thí nghiệm của mình
, ông đã xác định một chất tiểu thuyết trong nhân, mà
ông gọi là "nuclein" .2
Ông sau đó phát triển hai giao thức để
tách hạt nhân tế bào từ tế bào chất và để cô lập này mới
hợp chất, ngày nay được biết đến như DNA, mà khác với
protein và khác chất của tế bào. Phát hiện khoa học này,
cùng với các giao thức cách ly được sử dụng, được xuất bản năm
1871 với sự hợp tác với người thầy của mình, Felix Hoppe-Seyler.2,3
Tuy nhiên, đó chỉ là vào năm 1958 rằng Meselson và Stahl3,4
phát triển một quy trình xét nghiệm định kỳ để tách chiết DNA .
Họ thực hiện tách chiết DNA từ các mẫu vi khuẩn
Escherichia coli sử dụng một gradient ly tâm mật độ muối
giao thức. Kể từ đó, kỹ thuật chiết xuất DNA đã được
điều chỉnh để thực hiện nhổ trên nhiều loại khác nhau của
các nguồn sinh học.
Phương pháp tách chiết DNA theo một số thủ tục chung
nhằm đạt được sự gián đoạn có hiệu quả của các tế bào, sự biến tính
của các phức hợp nucleoprotein, bất hoạt của nucleases
và các enzym khác, loại bỏ các sinh vật và hóa
chất gây ô nhiễm, và cuối cùng precipitation.5 DNA
Hầu hết trong số họ
làm theo các bước cơ bản tương tự và bao gồm việc sử dụng phân hữu cơ và
thuốc thử nonorganic và phương pháp ly tâm. Cuối cùng,
họ đã phát triển thành một loạt các thủ tục tự động
và kits.1,5-7 thương mại có sẵn
Ban đầu, chúng tôi sẽ thảo luận về các giao thức và các bước nhằm
đạt được ly giải tế bào, hoạt tính của các men tế bào, sự biến tính
của các phức hợp di động, và kết tủa DNA,
đòi hỏi quy trình tương tự và / hoặc thuốc thử trong DNA
chiết xuất từ các mẫu máu toàn phần. Khác biệt quan trọng trong
các bước nhằm loại bỏ các chất ô nhiễm sinh học và hóa học
sẽ được đánh dấu khi chúng ta thảo luận về mỗi giao thức
cụ thể.
Như đã đề cập trước đây, ly giải tế bào là một bước phổ biến ở
hầu hết các giao thức chiết DNA, và nó là đạt được thông
qua việc sử dụng các chất tẩy rửa, enzym. Sodium dodecyl
sulfate (SDS) và Triton ™ X-100 (Sigma-Aldrich, St Louis,
MO, USA) là những ví dụ của các chất tẩy rửa thông dụng dùng để hòa tan
màng tế bào. Các enzyme cũng được kết hợp với các chất tẩy rửa
để nhắm mục tiêu bề mặt tế bào hoặc các thành phần cytosolic. Proteinase K là một
enzyme thường được sử dụng được sử dụng trong các giao thức khác nhau để tách các glycoprotein
và bất hoạt RNases và DNases. Chất làm biến tính khác
như urê, muối guanidinium, và chaotropes hóa học cũng đã được sử dụng để phá vỡ các tế bào và làm bất hoạt các enzym tế bào,
nhưng chúng có thể ảnh hưởng đến chất lượng và axit nucleic yield.1,7-9
tủa DNA được thực hiện bằng cách thêm nồng độ cao
của muối đến các giải pháp chứa DNA, như cation từ muối
như ammonium acetate chống lại lực đẩy gây ra bởi các
điện tích âm của xương sống phosphate. Một hỗn hợp của DNA
và muối trong sự hiện diện của các dung môi như ethanol (có nồng độ
70% -80%) hoặc isopropanol (nồng độ cuối cùng của
40% -50%) gây ra axit nucleic kết tủa. Một số giao thức
bao gồm các bước rửa với ethanol 70% để loại bỏ muối thừa
ra khỏi ADN. Cuối cùng, các axit nucleic đang lơ lửng trong nước
hoặc đệm TE (10 mM Tris, 1 mM ethylenediaminetetraacetic
acid [EDTA]). 7-9 TE đệm thường được sử dụng trong thời gian dài hạn
lưu trữ DNA vì nó ngăn không cho nó bị hư hỏng bởi
nucleases, không đầy đủ pH, kim loại nặng, và quá trình oxy hóa của tự do
gốc tự do. Tris cung cấp một độ pH an toàn 7-8, và EDTA chelate
ion hóa trị hai được sử dụng trong hoạt động nuclease và chống hiện oxy hóa
thiệt hại từ metals.9 nặng
loại chính của chiết xuất DNA
phương pháp từ người toàn bộ
các mẫu máu
Bảng 1 cho thấy các loại chính và các tiểu thể loại của
chiết DNA phương pháp từ các mẫu máu được
thường được sử dụng tại các cơ sở nghiên cứu trên toàn thế giới. Phòng thí nghiệm
hóa chất thường được sử dụng cho từng giai đoạn của các axit nucleic
giao thức khai thác có trong bảng này để
làm nổi bật sự tương đồng và khác biệt giữa chúng.
Kỹ thuật chiết xuất DNA trong Bảng 1 sẽ được
thảo luận chi tiết hơn trong các phần sau, cùng với
một tóm tắt tóm tắt về lịch sử kỹ thuật và nền. Trong
những năm gần đây, một số các giao thức này đã được điều chỉnh để
Microdevices mà phát triển tổng phân tích hóa học thu nhỏ
hệ thống hoặc vi lỏng phân tích di truyền microchips.7,10
Tuy nhiên, chúng tôi sẽ giới hạn phạm vi xem xét của chúng tôi với những
kỹ thuật mà có sẵn cho acid nucleic macroscale
khai thác .
phương pháp tách chiết DNA giải pháp dựa trên
Như đã đề cập trước đó, các giao thức dựa trên dung dịch có hai
phương pháp chính: 1) phương pháp dựa trên dung dịch sử dụng hữu cơ
dung môi và 2) những người dựa trên một kỹ thuật ướp muối ra. Hơn nữa
mô tả của cả hai phương pháp sau.
Chiết DNA Giải pháp dựa trên
phương pháp sử dụng các dung môi hữu cơ
giao thức chiết DNA sử dụng org