Phân lập và nhân bản của gen GalOxF

Phân lập và nhân bản của gen GalOx
F. sambucinum MA1886 được trồng trong 50 mL Sabouraud trung bình (5 g L-1 peptone từ casein, 5 g L-1 peptone từ thịt, 10 g L-1 glucose, 10 g L-1 maltose, 5 g L-1 men giải nén) vào bình lắc ở 25 ° C và 110 rpm trong 3 ngày. Sợi nấm nấm đã được thu thập bằng cách ly tâm ở 4 ° C và 5000 × g trong 15 phút và pellet được rửa trong 50 ml dung dịch muối (5 g L-1 NaCl, 0,12 g L-1 MgSO4 · 7H2O). ADN hệ gen được phân lập từ 100 mg của đất sợi nấm đông lạnh trong nitơ lỏng của phenol-chloroform-khai thác như mô tả của Chomczynski và Sacchi [60]. Các gen mã hóa cho gao GalOx được khuếch đại bằng PCR sử dụng cặp mồi thoái hóa dựa trên các trình tự công bố từ sinh vật có liên quan (Số gia nhập: FGSG_11032.3 / M86819 / FOXG_09956.2 / FVEG_08555.3): 5'-GCCTCAGCA / TCCC / TA / CTCGG -3 'và 5'-CTGAGTAACGA / CGAAG / TA / CGT-3', tinh chế bằng electrophoreses gel agarose và subcloned vào pJET 1.2 cloning vector sử dụng CloneJET PCR Cloning Kit (Fermentas). Hạn chế các trang web đã được giới thiệu cách sử dụng các đoạn mồi sau về phía trước: 5'-TCGCACATATGTACCTTTTGTCACTCGCTC-3 'và 5'-GCTGACATATGGCCTCAGCACCCATTGGA-3' cho gao có và không có trình tự prepro, tương ứng, và 5'-GCTACGCGGCCGCCTGAGTAACGCGAAT-3 'làm mồi ngược (hạn chế các trang web được gạch dưới). Sau đó, các sản phẩm PCR đã được tiêu hóa với NdeI và Noti và nhân bản trong đối xử bình đẳng pET21a vector biểu hiện trong khung hình với C-terminal His6-tag của Rapid DNA thắt Kit. Các plasmid kết quả đã được chuyển đổi thành E. coli BL21 (DE3) bởi electroporation. Trình tự DNA được thực hiện như một dịch vụ thương mại (LGC Genomics; Berlin, Đức). Các chuỗi axit amin có nguồn gốc từ các gen GalOx được sử dụng để
tạo ra một mô hình ba chiều dựa trên các cấu trúc được công bố của GalOx từ F. graminearum [5] sử dụng SWISS-MODEL [61], [62] và [63].