Fresh cut ripe kiwi fruit (Actinidi

Fresh cut ripe kiwi fruit (Actinidia deliciosa cv. Hayward)
was briefly patted on a tissue to remove excess fluid on the
cut surface, before pressing firmly onto a moisturised
nitrocellulose membrane [soaked in ultrapure water
(organic free, 18 MX cm resistance) for 15 min] for 20 s.
Once the nitrocellulose membrane was dried (*30 min),
the membrane was blocked with TBS containing 10% (w/v)
non-fat dry milk. Hereafter, the primary antibody was added
(25 lg/mL in TBS with 1% non-fat dry milk) followed by a
washing step and incubation with the secondary antibody,
goat-anti-mouse-HRP (Bio-rad, diluted 1:2,000 in TBS with
1% non-fat dry milk). After a final wash with TBS,
the development was finished using the ECL staining kit
(GE Healthcare), for chemiluminescence signal detection.
MA-T1C10 was used as a control MA.
Plant extracts
Extracts were made from two different kiwi fruit species in
analogy with the method described by Balestrieri et al.
(1990). Green kiwi (Actinidia deliciosa cv. Hayward) and
gold kiwi (Actinidia chinensis cv. Hort16A) were purchased
from a local supermarket. About 1 kg of fruits was
peeled and homogenised in water containing 7.5% PVPP
(2:1 w/v). Assuming that a possible inhibitor of PME
would be water soluble, the supernatant of the mixture was
collected after centrifugation at 20,000g for 20 min (4C).
Then, the supernatant was filtered and subjected to
ammonium sulfate precipitation. The fraction precipitating
between 25 and 70% ammonium sulfate saturation was
isolated and dissolved in a small volume of 20 mM Tris–
HCl pH 7.0. This extract was subjected to SDS-PAGE
analysis followed by western blotting (as described above).
Specimen preparation for microscopy
Blocks of parenchyma cells from the columella were fixed
in 4% (w/v) paraformaldehyde and 0.3% glutaraldehyde in
0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) at room temperature
using vacuum impregnation (20 min, 10 kPa). Pressure
was built up slowly, followed by overnight incubation
of the samples in fixative at 4C (atmospheric pressure).
Subsequently, the samples were washed with 0.1 M
sodium phosphate buffer (pH 7.0) and stored in 70% (v/v)
ethanol before cryosectioning into approximately 40 lm
thick sections with a cryomicrotome (Reichert). As negative
control, kiwi columella puree was extracted with water
or with a high ionic strength buffer (0.2 M Tris–HCl buffer
containing 1.0 M NaCl, pH 8.0) overnight at 4C. The
supernatant was removed after centrifugation (5 min,
10.000g, 4C) and the pellet was fixed with 4% (w/v)

Kết quả (Việt) 1:

Tươi cắt trái cây chín kiwi (Actinidia deliciosa var. Hayward)được một thời gian ngắn patted trên khăn giấy để loại bỏ chất lỏng dư thừa trên cáccắt bề mặt, trước khi ép chặt vào một moisturisednitrocellulose màng [ngâm trong nước ultrapure(hữu cơ miễn phí, 18 MX cm kháng) cho 15 phút] 20 s.Một khi các màng tế bào nitrocellulose được sấy khô (* 30 phút),Các màng tế bào bị chặn với TBS có chứa 10% (w/v)sữa bò mỡ. Kể từ câu này, kháng thể chủ yếu đã được bổ sung(25 lg/mL ở TBS với 1% mỡ sữa) theo sau là mộtrửa bước và ủ với kháng thể trung học,dê-anti-chuột-HRP (Bio rad, 1:2,000 pha loãng trong TBS với1% mỡ sữa). Sau khi một rửa cuối cùng với TBS,sự phát triển đã được hoàn thành bằng cách sử dụng ECL nhuộm kit(GE Healthcare), chemiluminescence tín hiệu phát hiện.MA-T1C10 đã được sử dụng như một điều khiển MA.Chất chiết xuất từ thực vậtChất chiết xuất đã được thực hiện từ hai loài quả kiwi khác nhau trongtương tự với phương pháp mô tả bởi Balestrieri et al.(1990). màu xanh lá cây kiwi (Actinidia deliciosa var. Hayward) vàvàng kiwi (Actinidia chinensis var. Hort16A) đã được muatừ một siêu thị địa phương. Khoảng 1 kg hoa quảbóc vỏ và homogenised trong nước có chứa 7,5% PVPP(2:1 w/v). Giả sử rằng một chất ức chế có thể PMEcó thể hòa tan trong nước, supernatant hỗn hợpthu thập sau khi số 20.000 g cho 20 phút (4 C).Sau đó, supernatant đã được lọc và phải chịu sựamoni sulfat mưa. Phần kết tủatừ 25 đến 70% amoni sulfat bão hòabị cô lập và hòa tan trong một thể tích nhỏ 20 mM Tris-HCl pH 7,0. Chiết xuất này đã phải chịu để dùng mũi SDS-TRANGphân tích theo phương Tây thấm (như mô tả ở trên).Để chuẩn bị mẫu cho kính hiển viTrong số các khối tế bào nhu mô columella đã được cố địnhtrong 4% (w/v) paraformaldehyde và 0,3% glutaraldehyde trong0.1 bộ đệm natri photphat M (pH 7,0) ở nhiệt độ phòngsử dụng chân không ngâm, tẩm (20 phút, 10 kPa). Áp lựcđược xây dựng lên từ từ, theo sau là ủ qua đêmCác mẫu trong các định hình tại 4 C (áp suất khí quyển).Sau đó, các mẫu đã được rửa sạch với 0.1 Mnatri phosphat đệm (pH 7,0) và lưu trữ trong 70% (v/v)cồn trước khi cryosectioning vào khoảng 40 lmdày phần với một cryomicrotome (Reichert). Như tiêu cựckiểm soát, kiwi columella puree được chiết xuất bằng nướchoặc với một cường độ cao ion đệm (cách 0.2 M Tris-HCl đệmcó chứa 1.0 M NaCl, pH 8,0) nghỉ đêm tại 4 C. cácsupernatant đã được gỡ bỏ sau khi số (5 phút,10,000 g, 4 C) và miếng đã được cố định với 4% (w/v)

Kết quả (Việt) 2:

Cắt tươi kiwi chín trái cây (chi dương đào Deliciosa cv. Hayward)
đã được một thời gian ngắn vỗ về một mô để loại bỏ chất lỏng dư thừa trên
bề mặt cắt, trước khi nhấn vững chắc vào một moisturised
nitrocellulose màng [ngâm trong nước siêu sạch
(hữu cơ miễn phí, 18 MX cm kháng) cho 15 phút] trong 20 s.
Khi màng nitrocellulose được sấy khô (* 30 phút),
màng đã bị chặn lại với TBS có chứa 10% (w / v)
sữa không chất béo. Sau đây, các kháng thể chính đã được bổ sung
(25 lg / mL trong TBS với sữa khô 1% không chất béo) theo sau là một
bước giặt và ủ với kháng thể thứ cấp,
dê-chống-chuột-HRP (Bio-rad, pha loãng 1: 2.000 trong TBS với
1% sữa không chất béo). Sau khi rửa cuối cùng với TBS,
sự phát triển đã được hoàn thành bằng cách sử dụng bộ ECL nhuộm
(GE Healthcare), để phát hiện tín hiệu Chemiluminescence.
MA-T1C10 đã được sử dụng như một điều khiển MA.
Nhà máy chiết xuất từ
chiết xuất đã được thực hiện từ hai loài trái kiwi khác nhau trong
tương tự với phương pháp mô tả bởi Balestrieri et al.
(1990). Kiwi xanh (chi dương đào Deliciosa cv. Hayward) và
kiwi vàng (Actinidia chinensis cv. Hort16A) được mua
từ một siêu thị địa phương. Khoảng 1 kg trái cây đã được
gọt vỏ và đồng nhất trong nước có chứa 7,5% PVPP
(2: 1 w / v). Giả sử một chất ức chế có thể có của PME
sẽ được hòa tan trong nước, phần nổi của hỗn hợp đã được
thu thập sau khi ly tâm ở 20,000g trong 20 phút (4 ° C).
Sau đó, nổi được lọc và bị
kết tủa ammonium sulfate. Các phần kết tủa
từ 25 đến 70% ammonium sulfate bão hòa đã được
phân lập và hòa tan trong một lượng nhỏ 20 mM Tris-
HCl pH 7.0. Chiết xuất này đã bị SDS-PAGE
phân tích tiếp theo tây thấm (như mô tả ở trên).
Mẫu chuẩn bị cho kính hiển vi
khối của các tế bào nhu mô từ Columella được cố định
trong 4% (w / v) paraformaldehyde và 0,3% trong glutaraldehyde
0,1 M sodium phosphate đệm (pH 7.0) ở nhiệt độ phòng
bằng ngâm tẩm chân không (20 phút, 10 kPa). Áp lực
được xây dựng lên từ từ, tiếp theo là ủ qua đêm
của các mẫu trong định hình tại 4? C (áp suất khí quyển).
Sau đó, các mẫu được rửa sạch với 0,1 M
đệm sodium phosphate (pH 7.0) và được lưu trữ trong 70% (v / v)
ethanol trước cryosectioning vào khoảng 40 lm
phần dày với một cryomicrotome (Reichert). Như tiêu cực
kiểm soát, kiwi Columella nhuyễn được chiết xuất bằng nước
hoặc với một bộ đệm cao ion mạnh (0,2 đệm M Tris-HCl
có chứa 1,0 M NaCl, pH 8,0) qua đêm ở 4 ° C. Các
bề đã được gỡ bỏ sau khi ly tâm (5 phút,
10.000g, 4? C) và dạng viên đã được cố định với 4% (w / v)