mRNA transcript quantificationTotal

mRNA transcript quantification
Total RNA was extracted from Arabidopsis leaves as described
(Chomczynski and Sacchi, 1987). We extracted soybean RNA by
mixing approximately 100 mg ground, frozen leaf material with
600 lL of lysis buffer (2%, w/v, ultrapure SDS, 68 mM trisodium
citrate, 132 mM citric acid, 1 mM EDTA, pH ~3.5). Then, protein
was settled by adding 200 lL precipitation buffer (4 M NaCl,
17 mM trisodium citrate, 33 mM citric acid, pH ~3.5) and 5 min
incubation on ice. After centrifugation at 12,000 g. for 5 min and
at room temperature in a minifuge, the supernatant was
transferred to fresh test tubes and RNA precipitated for 15 min
with 600 lL isopropanol. Upon further centrifugation for 5 min
in a minifuge, we washed the pellets with 70% (v/v) ethanol,
dried shortly and resuspended them in 30 lL RNAse-free ultra-
pure water. Independent of the origin (Arabidopsis, soybean or
P. pachyrhizi), RNA was reverse transcribed to cDNA using 9-mer
random primers and RevertAidTM reverse transcriptase (Thermo
Fisher Scientific, St. Leon-Rot, Germany), as described by the
manufacturer. cDNA was used in qRT-PCR with SYBR Green
(Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot, Germany) to determine
the level of obtained gene-specific cDNA. qRT-PCR was carried
out as described (Langenbach et al., 2013; van de Mortel et al.,
2007). Primers were designed standard (Udvardi et al., 2008) and
blasted for putative off target binding using the Primer Blast tool
at NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/).
Table S2 lists the primers used for mRNA quantification.

Kết quả (Việt) 1:

mRNA bảng điểm định lượngTất cả RNA được chiết xuất từ lá Arabidopsis như mô tả (Chomczynski và Sacchi, 1987). Chúng tôi trích xuất đậu nành RNA bởi trộn khoảng 100 mg đất, đông lạnh lá tài liệu với 600 lL lysis đệm (2%, w/v, ultrapure SDS, 68 mM trisodium citrat, 132 mM axít citric, 1 mM EDTA, pH ~ 3,5). Sau đó, protein đã được giải quyết bằng cách thêm 200 lL mưa đệm (4 M NaCl,17 mM trisodium citrat, axít citric 33 mM, độ pH ~ 3,5) và 5 phút ấp trứng trên băng. Sau khi số tại 12.000 g. cho 5 phút và ở nhiệt độ phòng trong một minifuge, supernatant là ống nghiệm chuyển giao cho tươi và RNA kết tủa trong 15 phút với 600 lL isopropanol. Khi thêm số cho 5 phút trong một minifuge, chúng tôi rửa các viên với 70% (v/v) ethanol, khô ngay và resuspended họ trong 30 lL miễn phí RNAse ultra -nước tinh khiết. Độc lập về nguồn gốc (Arabidopsis, đậu nành hoặcP. pachyrhizi), RNA được đảo ngược phiên âm để cDNA bằng cách sử dụng 9-mer ngẫu nhiên chất nền, mồi và RevertAidTM ngược (nhiệt Fisher khoa học, St. Leon-Rot, Đức), như được mô tả bởi các nhà sản xuất. cDNA được sử dụng trong Đảng Cộng sản Romania qRT với màu xanh lá cây SYBR (Nhiệt Fisher khoa học, St. Leon-Rot, Đức) để xác định mức độ thu được dành riêng cho gen cDNA. Đảng Cộng sản Romania qRT được thực hiện ra như được mô tả (Langenbach et al., 2013; van de Mortel et al., Năm 2007). chất nền, mồi là thiết kế tiêu chuẩn (Udvardi và ctv., 2008) và thổi cho giả định ra mục tiêu ràng buộc bằng cách sử dụng công cụ mồi nổ tại NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). S2 bảng liệt kê các chất nền, mồi được sử dụng cho mRNA định lượng.

Kết quả (Việt) 2:

mRNA bảng điểm định lượng
RNA tổng số được tách chiết từ cây Arabidopsis lá như mô tả
(Chomczynski và Sacchi, 1987). Chúng tôi trích RNA đậu tương
trộn khoảng 100 mg mặt đất, vật liệu lá đông lạnh với
600 lL của lysis buffer (2%, w / v, siêu sạch SDS, 68 mM trisodium
citrate, 132 mM axit citric, 1 mM EDTA, pH ~ 3,5). Sau đó, protein
đã được giải quyết bằng cách thêm 200 lL mưa đệm (4 M NaCl,
17 mM trisodium citrate, acid citric 33 mM, pH ~ 3,5) và 5 phút
ủ trên băng. Sau khi ly tâm ở 12.000 g. 5 phút và
ở nhiệt độ phòng trong một minifuge, phần nổi được
chuyển giao cho các ống nghiệm tươi và RNA kết tủa trong 15 phút
với 600 lL isopropanol. Sau khi ly tâm hơn nữa trong 5 phút
trong một minifuge, chúng tôi rửa sạch thức ăn viên với 70% (v / v) ethanol,
khô ngay và lơ lửng họ trong siêu 30 lL RNase free
nước tinh khiết. Độc lập về nguồn gốc (Arabidopsis, đậu tương hoặc
P. pachyrhizi), RNA được phiên mã ngược để cDNA dùng 9-mer
mồi ngẫu nhiên và RevertAidTM sao chép ngược (Thermo
Fisher Scientific, St. Leon-Rot, Đức), như mô tả của các
nhà sản xuất. cDNA được sử dụng trong QRT-PCR với SYBR Xanh
(Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot, Đức) để xác định
mức độ đạt được cDNA gen cụ thể. QRT-PCR được thực
hiện như mô tả (Langenbach et al 2013,;. van de Mortel et al,.
2007). Mồi được thiết kế tiêu chuẩn (Udvardi et al., 2008) và
thổi cho giả định ra mục tiêu gắn kết bằng cách sử dụng công cụ Blast Primer
tại NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/).
Bảng S2 liệt kê các mồi sử dụng để xác định số lượng mRNA.