electrophoresis allowing a good sep

electrophoresis allowing a good separation of the fragments can be determined experimentally by loading different samples on a parallel gel at constant time intervals.The fragments to be loaded on DGGE gels are usually PCR products. An optimal resolution is obtained when the molecules do not completely denature. The addition of a 30- to 40-bp GC clamp to one of the PCR primers insures that the fragment of DNAwill remain partially double-stranded and that the region screened is in the lowest melting domain (Myers et al., 1985; Sheffield et al.,1989). Chemiclamps are psoralen- derivatised PCR primers that can be used as alternative to GC clamps providing the same effect (Fu¨hr, 1996). However, as the chemiclamps are covalently linked to the DNA strands at one end, they cannot be used when DGGE fragments are to be sequenced because the bands cannot be reamplified directly, unless nested primers are used. The melting behaviour of double-stranded DNA has been described by a computer model developed by Lerman et al. (1984). Computer software is available, such as MacMeltk (Bio-Rad, Hercules, USA), which can calculate DNA melting profiles and show regions of theoretically high and low stability domains of a known sequence. Placement of primers and GC clamps can thus be optimised by analysis of the placement effect on the DNA melting profile. Bands in DGGE fingerprints can be revealed by ethidium bromide staining. The most sensitive procedure is silver staining (Felske et al., 1996), although silver-stained gels cannot be used for hybridisation experiments and single-strand DNA fragments are also detected. SYBER Green I is also an alternative for visualising DGGE gels (Muyzer et al., 1997). SYBER Green staining does not give background staining, thus allowing the detection of DNA fragments even at very low concentrations. The DGGE equipment is supplied by different companies such as Bio-Rad, INGENY (Leiden, The Netherlands), and CBS Scientific (Del Mar, USA).

Kết quả (Việt) 2:

điện cho phép một tách tốt của các mảnh vỡ có thể được xác định bằng thực nghiệm bằng cách tải mẫu khác nhau trên gel song song ở thời gian liên tục intervals.The mảnh vỡ được nạp vào DGGE gel thường được sản phẩm PCR. Một độ phân giải tối ưu thu được khi các phân tử không hoàn toàn biến tính. Việc bổ sung một 30 đến 40-bp GC kẹp với một trong các mồi PCR đảm bảo rằng các mảnh vỡ của DNAwill vẫn còn một phần sợi kép và rằng khu vực chiếu là trong lĩnh vực nóng chảy thấp nhất (Myers et al, 1985;. Sheffield et al., 1989). Chemiclamps là mồi PCR dẫn xuất psoralen- mà có thể được sử dụng như thay thế cho kẹp GC cung cấp các hiệu ứng tương tự (FUHR, 1996). Tuy nhiên, khi được đồng hóa trị chemiclamps liên kết với các sợi DNA ở một đầu, họ có thể không được sử dụng khi các mảnh DGGE đang được giải mã bởi vì ban nhạc không thể được reamplified trực tiếp, trừ khi mồi lồng nhau được sử dụng. Các hành vi nóng chảy của DNA sợi kép đã được mô tả bởi một mô hình máy tính phát triển bởi Lerman et al. (1984). Phần mềm máy tính có sẵn, chẳng hạn như MacMeltk (Bio-Rad, Hercules, Hoa Kỳ), trong đó có thể tính toán profile tan DNA và khu vực cho thấy các lĩnh vực ổn định về mặt lý thuyết cao và thấp của một trình tự đã biết. Vị trí của đoạn mồi và kẹp GC do đó có thể được tối ưu hóa bằng cách phân tích các ảnh hưởng vị trí trên các hồ sơ nóng chảy DNA. Ban nhạc trong DGGE dấu vân tay có thể được tiết lộ bởi thuốc nhuộm ethidium bromide. Thủ tục nhạy cảm nhất là nhuộm bạc (Felske et al., 1996), mặc dù gel bạc màu không thể được sử dụng cho các thí nghiệm lai giống và các mảnh vỡ DNA đơn sợi cũng được phát hiện. SYBER xanh tôi cũng là một sự thay thế cho việc hình dung DGGE gel (Muyzer et al., 1997). SYBER xanh nhuộm không cung cấp cho nền nhuộm, do đó cho phép phát hiện các mảnh vỡ DNA ngay cả ở nồng độ rất thấp. Các thiết bị DGGE được cung cấp bởi các công ty khác nhau như Bio-Rad, INGENY (Leiden, Hà Lan), và CBS khoa học (Del Mar, USA).