The PCR itself may be a source of b

The PCR itself may be a source of bias in molecular studies of food samples. Differential or
preferential amplification of rDNA genes by PCR was reported by Reysenbach et al. (1992). It was
found that preferential amplification might be caused by reannealing of the template DNA, which
compromises the hybridisation of the primers (Suzuki and Giovannoni, 1996). Attempts to overcome
these problems have been carried out; solvents or other substances capable of enhancing the
denaturation of the DNA have been added to the PCR mixtures (Reysenbach et al., 1992; Varadaraj
and Skinner 1994). Because of preferential amplification, a mixture of bacterial DNA from a complex community may be only partially amplified by PCR, thereby leading to a product where some of the original members of the community are missing. Preferential amplification may represent a problem for the PCR-DGGE analysis of microbial communities from food. In fact, the number of species detected may not be real because of a lack of amplification by PCR of a specific DNA template. Therefore, the choice of the primer couple and the fragment to target is fundamental. It has been shown that, sometimes, targeting different 16S variable regions may lead to different results in species composition of the same sample (Ercolini et al.,
2003a). In fact, the presence of Leuconostoc in Stilton cheese could be revealed only by analysing the region V4–V5 of the 16S rDNA while the species was not detected when the region V3 was targeted (Ercolini et al., 2003a). Do we need to target more variable regions in every analysis? This would make the analysis time-consuming. However, even though one region is targeted, other experiments should be done to ascertain whether other microbial species are present but not detected. Other problems are the formation of chimeric (Liesack et al., 1991; Kopczynski et al., 1994) or heteroduplex molecules (Ferris et al., 1997), which
can affect the distribution of the bands in the DGGE profile. These points were already discussed in a previous review on the application of PCR-DGGE in microbial ecology (Muyzer and Smalla, 1998). The fragments to be resolved by DGGE cannot be longer than 500 bp. This represents a limiting factor for the sequence analysis and eventually probe design. It also makes it difficult, sometimes, to achieve a reliable identification of the microbial species because the sequences from DGGE bands to be compared in the databases are relatively small 16S rDNA fragments not always different within the same genus. Moreover, it is not always possible to resolve DGGE fragments when the difference in sequence is not that wide; this is strongly affected by the electrophoretic conditions and the amplicon-specific formation of
melting domains. Furthermore, comigration of DNA fragments can be a problem for retrieving clean sequences from individual bands. In fact, even being different in sequences, the 16S rDNA fragments might have identical melting behaviour and therefore they cannot be separated in DGGE.
Another problem in the study of community diversity on the basis of 16S rRNA genes using DGGE is
the presence of multiple copies of the 16S rDNA gene with sequence microheterogeneity. A single species with multiple rRNA copies can display, indeed, a DGGE profile characterised by multiple bands, which overestimates the community diversity detected by DGGE (Nu¨bel et al., 1996). For example, multiple bands are displayed in DGGE profiles of the 16S rDNA V1 region by some species of lactobacilli and staphylococci of food origin (Cocolin et al., 2001c); moreover, multiple bands were also found for species of staphylococci by DGGE analysis of the region V3 (Cocolin et al., 2001b; Blaiotta et al., 2003). Attempts have been carried out in order to establish
the detection limit of the PCR-DGGE. Indeed, it is worthwhile to define the concentration of the microbial species, which is needed in the food matrix to reveal a band in a DGGE fingerprint. However, for only one or a few species, dilution series have been applied in PCR-DGGE after DNA extraction. Detection limits have been indicated, ranging between 104 and 108 cfu ml
1 (Dewettinck et al., 2001; Ogier et al., 2002; Fasoli et al., 2003; Temmerman et al., 2003;
Ercolini et al., unpublished). As a matter of fact, the detection limit depends on the species and perhaps even the strain considered. Moreover, the number and the concentration of the other members of the microbial community, along with the nature of the food matrix, all represent variables influencing the detection limit of DGGE by affecting both the efficiency of DNA extraction and the PCR amplification due to the possible competition among templates.

Kết quả (Việt) 1:

Đảng Cộng sản Romania chính nó có thể là một nguồn thiên vị trong các nghiên cứu phân tử thực phẩm mẫu. Vi sai hoặcCác khuếch đại ưu đãi của rDNA gen bởi Đảng Cộng sản Romania đã được báo cáo bởi Reysenbach et al. (1992). Nó đãtìm thấy rằng ưu đãi khuếch đại có thể được gây ra bởi reannealing của các mẫu DNA, màthỏa hiệp lai lớp lót (Suzuki và Giovannoni, 1996). Cố gắng để vượt quanhững vấn đề này đã được thực hiện ra; rửa hoặc các chất khác có khả năng tăng cường cácdenaturation của DNA đã được thêm vào hỗn hợp Đảng Cộng sản Romania (Reysenbach et al., 1992; Varadarajvà Skinner 1994). Vì ưu đãi khuếch đại, một hỗn hợp của vi khuẩn DNA từ một cộng đồng phức tạp có thể được chỉ có một phần khuyếch đại bởi PCR, do đó dẫn đến một sản phẩm mà một số thành viên ban đầu của cộng đồng là mất tích. Ưu đãi khuếch đại có thể đại diện cho một vấn đề cho các đảng Cộng sản Romania-DGGE phân tích của cộng đồng vi sinh vật từ thực phẩm. Trong thực tế, số lượng loài được phát hiện có thể không được thực sự vì thiếu khuếch đại bởi PCR của một mẫu DNA cụ thể. Vì vậy, sự lựa chọn của các cặp vợ chồng mồi và mảnh để nhắm mục tiêu là cơ bản. Nó đã được chỉ ra rằng, đôi khi, nhắm mục tiêu khác nhau 16 biến vùng có thể dẫn đến các kết quả khác nhau trong loài thành phần của cùng một mẫu (Ercolini et al.,2003a). trong thực tế, sự hiện diện của Leuconostoc trong pho mát Stilton có thể được tiết lộ chỉ bằng cách phân tích vùng V4-V5 rDNA 16 trong khi các loài không được phát hiện khi vùng V3 nhắm mục tiêu (Ercolini và ctv., 2003a). Chúng ta có phải nhắm mục tiêu các khu vực nhiều biến trong phân tích mỗi? Điều này sẽ làm cho việc phân tích tốn thời gian. Tuy nhiên, mặc dù một vùng được nhắm mục tiêu, thử nghiệm khác nên được thực hiện để xác định liệu các loài vi khuẩn có mặt nhưng không được phát hiện. Các vấn đề khác là hình thành của chimeric (Liesack et al., 1991; Kopczynski et al., 1994) hoặc heteroduplex phân tử (Ferris et al., 1997), màcó thể ảnh hưởng đến sự phân bố của các ban nhạc trong hồ sơ DGGE. Những điểm này đã thảo luận trong một bài đánh giá trước đó về việc áp dụng của Đảng Cộng sản Romania-DGGE trong vi khuẩn sinh thái (Muyzer và Smalla, 1998). Các mảnh vỡ để được giải quyết bởi DGGE không thể dài hơn 500 bp. Điều này đại diện cho một yếu tố hạn chế cho các phân tích trình tự và cuối cùng là thăm dò thiết kế. Nó cũng làm cho nó khó khăn, đôi khi, để đạt được một nhận dạng đáng tin cậy của các loài vi khuẩn bởi vì các trình tự từ các ban nhạc DGGE để được so sánh với các cơ sở dữ liệu là tương đối nhỏ 16 rDNA mảnh không phải luôn luôn khác nhau trong cùng một chi. Hơn nữa, nó không phải là luôn luôn có thể để giải quyết DGGE mảnh khi sự khác biệt theo thứ tự không có nghĩa rộng; Điều này mạnh mẽ bị ảnh hưởng bởi điều kiện electrophoretic và thành lập dành riêng cho ampliconnóng chảy tên miền. Hơn nữa, comigration mảnh DNA có thể là một vấn đề để lấy trình tự sạch từ các ban nhạc cá nhân. Trong thực tế, thậm chí là khác nhau trong chuỗi, các mảnh vỡ rDNA 16 có thể có hành vi nóng chảy giống hệt nhau và do đó họ không thể được tách ra trong DGGE.Một vấn đề trong nghiên cứu của cộng đồng đa dạng trên cơ sở 16S rRNA Gene bằng cách sử dụng DGGE làsự hiện diện của nhiều bản sao của 16 rDNA gen với chuỗi microheterogeneity. Một loài duy nhất với nhiều rRNA bản sao có thể hiển thị, thực sự, một hồ sơ DGGE đặc trưng bởi nhiều ban nhạc, mà quá đa dạng cộng đồng được phát hiện bởi DGGE (Nu¨bel và ctv., 1996). Ví dụ, nhiều ban nhạc được hiển thị trong DGGE hồ sơ của vùng V1 rDNA 16 bởi một số loài lactobacilli và staphylococci của nguồn gốc thực phẩm (Cocolin et al., năm 2001 của c); hơn nữa, nhiều ban nhạc được cũng tìm thấy cho loài staphylococci DGGE phân tích của vùng V3 (Cocolin et al., 2001b; Blaiotta et al., 2003). Nỗ lực đã được thực hiện để thiết lậpgiới hạn phát hiện của Đảng Cộng sản Romania-DGGE. Thật vậy, nó là đáng giá để xác định nồng độ của các loài vi khuẩn, đó là cần thiết trong ma trận thực phẩm để lộ một ban nhạc trong một dấu vân tay DGGE. Tuy nhiên, chỉ một hoặc một vài loài, pha loãng loạt đã được áp dụng trong Đảng Cộng sản Romania-DGGE sau khi khai thác DNA. Phát hiện giới hạn đã được chỉ ra, khác nhau, từ 104 đến 108 cfu ml 1 (Dewettinck et al., năm 2001; Cassi et al., 2002; Fasoli et al., 2003; Temmerman et al., 2003;Ercolini et al., chưa được công bố). Như một vấn đề của thực tế, giới hạn phát hiện phụ thuộc vào các loài và có lẽ ngay cả sự căng thẳng được coi là. Hơn nữa, số và nồng độ của các thành viên khác của cộng đồng vi sinh vật, cùng với bản chất của ma trận thực phẩm, tất cả các đại diện cho biến ảnh hưởng đến giới hạn phát hiện DGGE bởi ảnh hưởng đến hiệu quả của DNA khai thác và khuếch đại PCR do sự cạnh tranh có thể trong số mẫu.

Kết quả (Việt) 2:

Các PCR cũng có thể là một sai lệch trong nghiên cứu phân tử của mẫu thực phẩm. Differential hay
khuếch đại ưu đãi của các gen rDNA bằng PCR đã được báo cáo bởi Reysenbach et al. (1992). Nó đã được
tìm thấy rằng khuếch đại ưu đãi có thể được gây ra bởi reannealing của DNA mẫu, trong đó
phương hại tới việc lai của mồi (Suzuki và Giovannoni, 1996). Những nỗ lực để khắc phục
những vấn đề này đã được thực hiện; dung môi hay các chất khác có khả năng tăng
sự biến tính của DNA đã được thêm vào hỗn hợp PCR (Reysenbach et al 1992,;. Varadaraj
và Skinner 1994). Bởi vì khuếch đại ưu đãi, một hỗn hợp DNA của vi khuẩn từ một cộng đồng phức tạp có thể được khuếch đại chỉ có một phần bởi PCR, từ đó dẫn đến một sản phẩm mà một số thành viên ban đầu của cộng đồng đang mất tích. Khuếch đại ưu đãi có thể là một vấn đề đối với việc phân tích PCR-DGGE của cộng đồng vi khuẩn từ thực phẩm. Trong thực tế, số lượng các loài được phát hiện có thể không thực sự vì thiếu khuếch đại bằng PCR của một mẫu DNA cụ thể. Vì vậy, sự lựa chọn của các cặp vợ chồng mồi và đoạn với mục tiêu là cơ bản. Nó đã được chỉ ra rằng, đôi khi, mục tiêu khác nhau 16S vùng biến đổi có thể dẫn đến kết quả khác nhau về thành phần loài của cùng một mẫu (Ercolini et al.,
2003a). Trong thực tế, sự hiện diện của Leuconostoc trong pho mát Stilton có thể được tiết lộ chỉ bằng cách phân tích các khu vực V4-V5 của 16S rDNA trong khi các loài không được phát hiện khi các khu vực V3 được mục tiêu (Ercolini et al., 2003a). Nào chúng ta cần hướng đến vùng biến nhiều hơn trong mỗi phân tích? Điều này sẽ làm tốn nhiều thời gian phân tích. Tuy nhiên, mặc dù một khu vực được nhắm mục tiêu, các thí nghiệm khác cần được thực hiện để xác định xem liệu loài vi sinh vật khác có mặt mà không được phát hiện. Vấn đề khác là sự hình thành của khảm (Liesack et al, 1991;.. Kopczynski et al, 1994) hay phân tử heteroduplex, trong đó (Ferris et al., 1997)
có thể ảnh hưởng đến sự phân bố của các ban nhạc trong hồ sơ DGGE. Những điểm này đã được thảo luận trong một bài đánh giá trước đây về ứng dụng của PCR-DGGE trong hệ sinh thái vi sinh vật (Muyzer và Smalla, 1998). Các mảnh vỡ để được giải quyết bằng DGGE không thể dài hơn 500 bp. Đây là một yếu tố hạn chế đối với việc phân tích trình tự và cuối cùng thăm dò thiết kế. Nó cũng làm cho nó khó khăn, đôi khi, để đạt được một đáng tin cậy xác các loài vi sinh vật bởi vì các chuỗi từ các ban nhạc DGGE để được so sánh trong các cơ sở dữ liệu tương đối nhỏ mảnh 16S rDNA không luôn luôn khác nhau trong cùng chi. Hơn nữa, nó không phải là luôn luôn có thể giải quyết DGGE mảnh vỡ khi sự khác biệt trong chuỗi không phải là rộng; này bị ảnh hưởng mạnh bởi các điều kiện điện di và sự hình thành amplicon cụ thể của
lĩnh vực nóng chảy. Hơn nữa, comigration các mảnh DNA có thể là một vấn đề để lấy chuỗi sạch từ băng cá nhân. Trong thực tế, thậm chí là khác nhau trong trình tự, các mảnh vỡ 16S rDNA có thể có hành vi nóng chảy giống hệt nhau và do đó họ không thể tách rời trong DGGE.
Một vấn đề trong việc nghiên cứu sự đa dạng của cộng đồng trên cơ sở của các gen 16S rRNA sử dụng DGGE là
sự hiện diện của nhiều bản sao của gen 16S rDNA với chuỗi microheterogeneity. Một loài duy nhất với nhiều bản sao rRNA có thể hiển thị, thực sự, một hồ sơ DGGE đặc trưng bởi nhiều ban nhạc, mà overestimates sự đa dạng của cộng đồng phát hiện bởi DGGE (Nu¨bel et al., 1996). Ví dụ, nhiều ban nhạc được hiển thị trong các cấu DGGE của vùng 16S rDNA V1 của một số loài lactobacilli và khuẩn tụ cầu có nguồn gốc thực phẩm (Cocolin et al 2001c,.); Hơn nữa, nhiều ban nhạc cũng đã được tìm thấy cho loài tụ cầu bằng phân tích DGGE của V3 vùng (Cocolin et al, 2001b;.. Blaiotta et al, 2003). Những nỗ lực đã được thực hiện để thiết lập
các giới hạn phát hiện của phương pháp PCR-DGGE. Thật vậy, nó là đáng giá để xác định nồng độ của các loài vi sinh vật, đó là cần thiết trong ma trận thực phẩm để lộ một ban nhạc trong một dấu vân tay DGGE. Tuy nhiên, chỉ có một hoặc một vài loài, chuỗi pha loãng đã được áp dụng trong PCR-DGGE sau khi chiết DNA. Giới hạn phát hiện đã được chỉ định, dao động từ 104 đến 108 cfu ml? 1 (Dewettinck et al 2001,;. Ogier et al, 2002;.. Fasoli et al, 2003;. Temmerman et al, 2003;
. Ercolini et al, chưa xuất bản). Như một vấn đề của thực tế, giới hạn phát hiện phụ thuộc vào loài và có lẽ ngay cả những căng thẳng xem xét. Hơn nữa, số lượng và nồng độ của các thành viên khác của cộng đồng vi khuẩn, cùng với bản chất của ma trận thực phẩm, tất cả các đại diện cho các biến ảnh hưởng đến giới hạn phát hiện của DGGE do ảnh hưởng đến cả hiệu quả của chiết xuất DNA và khuếch đại PCR do các thể cạnh tranh giữa các mẫu.