184 L. Ward et al.Figure 1. Multipl

184 L. Ward et al.
Figure 1. Multiple alignment of all-available KBV sequences alongside ABPV sequences (for ABPV, if
more than one sequence is available with 100% identity in this region, only one of each sequence ‘type’
is shown), indicating the positions of the primers and probes designed (in boxes). Only polymorphic nucleotides
are shown, (.) indicates an identical nucleotide at that position.
The quantity of KBV virus in the UK and Australian
samples were extrapolated from the standard curve.
The virus concentrations were normalised by dividing
the inverse log of virus quantity by the inverse
log of the bee IPC quantity.
3. RESULTS
3.1. Real-time primer and probe design
Although KBV and ABPV are closely
related it was possible to discriminate between
the two viruses by designing TaqMan
primers and a probe to conserved region of
KBV sequence but where the ABPV sequence
was variable (Fig. 1, Tab. I). The KBV assay
gave a positive PCR result when tested with
3 purified virus preparations, KBV14, KBV16
and KBVNZ. No cross-reaction was observed
(no amplification after 40 PCR cycles) when
RNA was extracted from pure virus or bees
infected with the following viruses ABPV,
BQCV, SBV, CWV, SPV, DWV, CPV and
AIV. To confirm the presence of virus in the
pure virus preparations electron microscopy
was performed, and in each case virus particles
of the correct size were observed (data
not shown). For the viruses where sequence
was available (BQCV, SBV, DWV and AIV)
the presence of virus was confirmed by RTPCR/PCR
(data not shown). For Cloudy wing
virus (CWV) electron microscopy confirmed
the presence of virus particles of the correct
size, whilst the KBV assay did not detect viral
RNA, even though the available sequence
of CWV is identical to KBV. Although AIV
is a DNA virus it could still be detected in
the RNA extractions from infected bees using
PCR (without an RT step), indicating that suf-
ficient DNA was co-purified in the extraction
procedure to enable effective detection.
KBV was successfully detected in different
life stages of Apis mellifera L. including Australian
worker honey bees, worker pupae and
drone pupae. Some of the worker honey bees
from America also tested positive for the virus,
along with one Australian wasp (Vespula germanica).
This further indicates that the assay
developed is able to detect different sources
of KBV in A. mellifera as well as KBV in
different insect species. Detection in other insect
species is further supported by the successful
amplification of KBV sequence from
the virus preparation KBV16, obtained from a
bumblebee. The German bees all tested negative
for KBV, however, the internal control results
show that adequate levels of total RNA
had been extracted (Tab. II).
3.2. Survey of honeybee colonies
for KBV
RNA extracted from 5 bees in each survey
sample was tested with the real-time PCR
First detection of Kashmir bee virus in the UK 185
Table II. Results from testing known infected samples and samples suspected of being KBV-infected,
including the number of positive samples and the average Ct values and standard deviations for the KBV
assay in positive samples and the internal positive control assay in all samples extracted. The instrument
records a Ct value of 40 for the negative samples (-).
Source Sample type Number of positive Average Ct for KBV Average Ct for 18S assay
individuals tested positive samples for all samples
Australia Wasp pupa 1/2 24.36 23.52 ± 0.18
Australia Honey bee worker pupa 6/6 29.09 ± 3.28 14.64 ± 0.13
Australia Honey bee drone pupa 3/4 36.18 ± 1.66 14.48 ± 0.23
Australia Honey bee worker 3/10 35.36 ± 6.54 16.48 ± 1.20
Australia Honey bee worker 6/15 36.50 ± 1.63 23.24 ± 3.49
USA Honey bee worker 2/10 31.85 ± 1.45 16.39 ± 1.55
Germany Honey bee worker 0/10 - 17.59 ± 5.12
Germany Honey bee worker 0/10 - 17.38 ± 0.75
assays for the bee 18S rRNA (IPC). Using the
automated extraction method, RNA was successfully
recovered from all bee samples. A
similar extraction efficiency was observed for
all samples indicating that the method was reproducible.
The average real-time PCR Ct (denoted
by the point at which amplification is
first observed above the base threshold) value
for two replicates from 458 survey samples
was 10.39 ± 1.52.
Following testing using the KBV real-time
PCR assay, of the 458 samples tested, three
tested positive for the presence of KBV. Two
of the positive samples were detected in different
hives from the same apiary. Details of
these colonies are shown in Figure 2. One of
the sampled colonies was infected with European
foulbrood (a statutory notifiable disease)
and was destroyed as part of the national
disease control strategy. PCR products ampli-
fied during the real-time PCR testing were
cloned and sequenced. The sequence of the
cloned PCR product sequence was confirmed
to be KBV following a blast search on the
NCBI database which matched other KBV sequences
(Accessions AY275710, AF263723–
AF263732, AY452696).
3.3. Quantification of virus load in UK
bee samples
The quantity of KBV in the positive UK
samples were compared to Australian bees that
were known to be naturally infected with KBV
at low levels (non-symptomatic) or high levels
(showing clinical symptoms). A standard
curve method was used to quantify virus load
in the bees rather than the ∆Ct method as described
in Chen et al. (2005). When the relative
efficiencies of the bee IPC and KBV were
plotted as ∆Ct [Ct(KBV)−Ct(IPC) ], versus the log of
the RNA dilution, the ∆Ct had a value greater
than 0.1 (the slope was 0.9513), indicating that
the amplification efficiencies of KBV and bee
IPC were not equal. In this instance, the ∆Ct
method was not suitable for quantification. In
addition, as the starting level of virus and bee
IPC RNA in the standard dilutions was unknown,
relative rather than absolute quantifi-
cation was used.
A standard curve was constructed by plotting
Ct values of bee and KBV standard RNA
dilutions against the log of the RNA dilution.
The quantity of KBV and bee IPC RNA
from each bee was extrapolated from the standard
curve. The normalised quantity of KBV
in each bee was determined by dividing the
amount of KBV RNA by the amount of bee
IPC RNA. The results show that the virus levels
in the infected bees from the UK are similar
to those in bees with covert levels of infection
from Australia. In comparison, other bees
(also from Australia) believed to be highly infected,
contained around 400 times more virus
than the bees at the UK Manchester site and
100 times more virus than covertly infected
Australian bees and bees from the UK Hull site
(Fig. 3).
186 L. Ward et al.
Figure 2. A Map showing the locations of the 458 bee colonies sampled in the UK 2004 KBV survey
including the two colonies that tested positive for KBV (indicated by black diamonds).
4. DISCUSSION
This paper reports the first finding of KBV
in the UK and the first large-scale survey for
bee viruses in Europe using TaqMan technology.
This study demonstrates the practical application
of this technology as a support tool
for surveys and contingency management, and
to provide robust surveillance data on the presence
or otherwise of KBV and other honey bee
viruses.
The incorporation of an internal control assay
to detect the bee 18S rRNA gene allowed
the assessment of extraction efficiency and allowed
interpretation of false negative results.
First detection of Kashmir bee virus in the UK 187
Figure 3. Relative quantification of KBV in bee samples. (A) TaqMan Standard curves for KBV virus and
bee IPC. (B) Relative comparison of KBV levels in UK bees in relation to bees known to be naturally
infected with high and covert levels of KBV infection.
Also, the real-time PCR assays allowed the
quantitative assessment of virus levels over
several orders of magnitude. This proved to
be valuable for detection of low-titre infections
within the bees tested. In this study,
quantification of KBV levels in the UK bees
showed they contained similar levels to Australian
bees having covert infections. The bee
colonies from the UK sites showed no obvious
signs of virus infection at the time of collection
suggesting the virus was covert or latent
in these apiaries. It is known that the viruses
can exist in individual bees or entire colonies
for long periods without causing noticeable
clinical symptoms (Dall, 1985; Anderson and
Gibbs, 1988; Hung et al., 1996a, b). Studies
by Anderson and Gibbs (1988) showed that
covert virus infections were common in pupae
with KBV. The status and sites where the
virus may remain in the bee in this state are
unknown, however, it has been suggested the
lining of the gut may be the site of ‘unapparent’
or covert infection (Anderson and Gibbs,
1989). Anderson and Gibbs (1988) have stated
that these infections do possess a latent capacity
to become activated and develop into acute
infections.
Some studies have suggested that viruses
such as KBV and ABPV may exist as natural
infections in a broader range of genera other
than Apis. For example KBV has been detected
in the wasp Vespula germanica (Anderson,
1991) and ABPV in Bombus species (Bailey
and Gibbs, 1964). Our study provides further
support for this, as KBV was detected in the
same species of wasp and one of the KBV
serotypes tested was extracted from a bumblebee
from New Zealand. In terms of trade and
regulation of honeybee viruses between countries,
if these viruses exist in different insect
hosts, it makes such controls and restrictions
difficult to impose or justify. In view of this,
the full host-range of honeybee viruses warrants
further study.
At the time of sampling, all three KBV positive
UK colonies were in good condition, with
healthy numbers of adult bees and brood, however,
the colonies were infested with varroa
and one of the colonies was found to have European
foulbrood (EFB). The association of184 L. Ward et al.
Figure 1. Multiple alignment of all-available KBV sequences alongside ABPV sequences (for ABPV, if

Kết quả (Việt) 1:

184 L. Phường et al.Hình 1. Nhiều liên kết có sẵn tất cả KBV cuỗi cùng với trình tự ABPV (cho ABPV, nếunhiều hơn một trình tự có sẵn với 100% identity trong khu vực này, chỉ là một trong mỗi chuỗi 'loại'được hiển thị), chỉ ra vị trí của chất nền, mồi và đầu dò thiết kế (trong hộp). Chỉ bướu nucleotideĐang hiển thị, (.) cho biết một nucleotide giống hệt nhau tại vị trí đó.Số lượng KBV virus ở Anh và Úcmẫu đã suy luận từ các đường cong tiêu chuẩn.Nồng độ virus đã được normalised bằng cách chiađăng nhập nghịch đảo của vi rút số lượng bởi nghịch đảoNhật ký của số lượng IPC ong.3. KẾT QUẢ3.1. thời gian thực thiết kế mồi và thăm dòMặc dù KBV và ABPV là chặt chẽliên quan đến nó đã có thể phân biệt đối xử giữaCác virus hai bằng cách thiết kế TaqManchất nền, mồi và một tàu vũ trụ tới các khu vực bảo tồn củaKBV chuỗi nhưng nơi dãy ABPVđổi biến (hình 1, Tab. I). The KBV khảo nghiệmđã cho một đảng Cộng sản Romania tích cực kết quả khi thử nghiệm với3 chuẩn bị tinh khiết virus, KBV14, KBV16và KBVNZ. Không có cross-reaction được quan sát thấy(không có khuếch đại sau khi 40 PCR chu kỳ) khiRNA được chiết xuất từ tinh khiết virus hay con ongbị nhiễm virus sau ABPV,BQCV, nhà nước, CWV, SPV, DWV, CPV vàAIV. Để xác nhận sự hiện diện của virus trong cáckính hiển vi điện tử chuẩn bị tinh khiết virusđã được thực hiện, và trong mỗi trường hợp vi rút hạtKích thước chính xác đã được quan sát (dữ liệukhông hiển thị). Các virus nơi trình tựcó sẵn (BQCV, nhà nước, DWV và AIV)sự hiện diện của virus đã được xác nhận bởi RTPCR/PCR(dữ liệu không hiển thị). Cho cánh có mâykính hiển vi điện tử của virus (CWV), xác nhậnsự hiện diện của vi rút hạt chính xácKích thước, trong khi các khảo nghiệm KBV không thể phát hiện virusRNA, mặc dù trình tự có sẵncủa CWV là giống hệt nhau để KBV. Mặc dù AIVlà một virus ADN nó vẫn có thể được phát hiện trongnhổ RNA từ ong bị nhiễm bằng cách sử dụngĐảng Cộng sản Romania (mà không có một bước RT), chỉ ra rằng suf-ficient DNA là đồng tinh khiết trong việc khai thácthủ tục để cho phép phát hiện hiệu quả.KBV thành công được phát hiện trong khác nhaugiai đoạn cuộc sống của API mellifera L. bao gồm cả Úcnhân viên mật ong ong, công nhân pupae vàmục tiêu giả nhộng. Một số nhân viên mật ong ongtừ Mỹ cũng được thử nghiệm dương tính với vi rút,cùng với một chiếc wasp Úc (Vespula germanica).Điều này tiếp tục chỉ ra rằng các khảo nghiệmphát triển có thể phát hiện các nguồn khác nhaucủa KBV trong A. mellifera và KBV trongloài côn trùng khác nhau. Phát hiện trong côn trùng khácloài được hỗ trợ thêm bởi sự thành côngCác khuếch đại của KBV theo trình tự từchuẩn bị virus KBV16, thu được từ mộtong. Những con ong Đức tất cả nghiệm âm tínhcho KBV, Tuy nhiên, các kết quả kiểm soát nội bộHiển thị đầy đủ những gì cấp của tất cả RNAđã chiết xuất (Tab. II).3.2. cuộc khảo sát của thuộc địa ong mậtcho KBVRNA được chiết xuất từ các con ong 5 trong mỗi cuộc khảo sátmẫu đã được thử nghiệm với Đảng Cộng sản Romania thời gian thựcCác phát hiện đầu tiên của Kashmir ong virus ở Anh 185Table II. Results from testing known infected samples and samples suspected of being KBV-infected,including the number of positive samples and the average Ct values and standard deviations for the KBVassay in positive samples and the internal positive control assay in all samples extracted. The instrumentrecords a Ct value of 40 for the negative samples (-).Source Sample type Number of positive Average Ct for KBV Average Ct for 18S assayindividuals tested positive samples for all samplesAustralia Wasp pupa 1/2 24.36 23.52 ± 0.18Australia Honey bee worker pupa 6/6 29.09 ± 3.28 14.64 ± 0.13Australia Honey bee drone pupa 3/4 36.18 ± 1.66 14.48 ± 0.23Australia Honey bee worker 3/10 35.36 ± 6.54 16.48 ± 1.20Australia Honey bee worker 6/15 36.50 ± 1.63 23.24 ± 3.49USA Honey bee worker 2/10 31.85 ± 1.45 16.39 ± 1.55Germany Honey bee worker 0/10 - 17.59 ± 5.12Germany Honey bee worker 0/10 - 17.38 ± 0.75assays for the bee 18S rRNA (IPC). Using theautomated extraction method, RNA was successfullyrecovered from all bee samples. Asimilar extraction efficiency was observed forall samples indicating that the method was reproducible.The average real-time PCR Ct (denotedby the point at which amplification isfirst observed above the base threshold) valuefor two replicates from 458 survey sampleswas 10.39 ± 1.52.Following testing using the KBV real-timePCR assay, of the 458 samples tested, threetested positive for the presence of KBV. Two
of the positive samples were detected in different
hives from the same apiary. Details of
these colonies are shown in Figure 2. One of
the sampled colonies was infected with European
foulbrood (a statutory notifiable disease)
and was destroyed as part of the national
disease control strategy. PCR products ampli-
fied during the real-time PCR testing were
cloned and sequenced. The sequence of the
cloned PCR product sequence was confirmed
to be KBV following a blast search on the
NCBI database which matched other KBV sequences
(Accessions AY275710, AF263723–
AF263732, AY452696).
3.3. Quantification of virus load in UK
bee samples
The quantity of KBV in the positive UK
samples were compared to Australian bees that
were known to be naturally infected with KBV
at low levels (non-symptomatic) or high levels
(showing clinical symptoms). A standard
curve method was used to quantify virus load
in the bees rather than the ∆Ct method as described
in Chen et al. (2005). When the relative
efficiencies of the bee IPC and KBV were
plotted as ∆Ct [Ct(KBV)−Ct(IPC) ], versus the log of
the RNA dilution, the ∆Ct had a value greater
than 0.1 (the slope was 0.9513), indicating that
the amplification efficiencies of KBV and bee
IPC were not equal. In this instance, the ∆Ct
method was not suitable for quantification. In
addition, as the starting level of virus and bee
IPC RNA in the standard dilutions was unknown,
relative rather than absolute quantifi-
cation was used.
A standard curve was constructed by plotting
Ct values of bee and KBV standard RNA
dilutions against the log of the RNA dilution.
The quantity of KBV and bee IPC RNA
from each bee was extrapolated from the standard
curve. The normalised quantity of KBV
in each bee was determined by dividing the
amount of KBV RNA by the amount of bee
IPC RNA. The results show that the virus levels
in the infected bees from the UK are similar
to those in bees with covert levels of infection
from Australia. In comparison, other bees
(also from Australia) believed to be highly infected,
contained around 400 times more virus
than the bees at the UK Manchester site and
100 times more virus than covertly infected
Australian bees and bees from the UK Hull site
(Fig. 3).
186 L. Ward et al.
Figure 2. A Map showing the locations of the 458 bee colonies sampled in the UK 2004 KBV survey
including the two colonies that tested positive for KBV (indicated by black diamonds).
4. DISCUSSION
This paper reports the first finding of KBV
in the UK and the first large-scale survey for
bee viruses in Europe using TaqMan technology.
This study demonstrates the practical application
of this technology as a support tool
for surveys and contingency management, and
to provide robust surveillance data on the presence
or otherwise of KBV and other honey bee
viruses.
The incorporation of an internal control assay
to detect the bee 18S rRNA gene allowed
the assessment of extraction efficiency and allowed
interpretation of false negative results.
First detection of Kashmir bee virus in the UK 187
Figure 3. Relative quantification of KBV in bee samples. (A) TaqMan Standard curves for KBV virus and
bee IPC. (B) Relative comparison of KBV levels in UK bees in relation to bees known to be naturally
infected with high and covert levels of KBV infection.
Also, the real-time PCR assays allowed the
quantitative assessment of virus levels over
several orders of magnitude. This proved to
be valuable for detection of low-titre infections
within the bees tested. In this study,
quantification of KBV levels in the UK bees
showed they contained similar levels to Australian
bees having covert infections. The bee
colonies from the UK sites showed no obvious
signs of virus infection at the time of collection
suggesting the virus was covert or latent
in these apiaries. It is known that the viruses
can exist in individual bees or entire colonies
for long periods without causing noticeable
clinical symptoms (Dall, 1985; Anderson and
Gibbs, 1988; Hung et al., 1996a, b). Studies
by Anderson and Gibbs (1988) showed that
covert virus infections were common in pupae
with KBV. The status and sites where the
virus may remain in the bee in this state are
unknown, however, it has been suggested the
lining of the gut may be the site of ‘unapparent’
or covert infection (Anderson and Gibbs,
1989). Anderson and Gibbs (1988) have stated
that these infections do possess a latent capacity
to become activated and develop into acute
infections.
Some studies have suggested that viruses
such as KBV and ABPV may exist as natural
infections in a broader range of genera other
than Apis. For example KBV has been detected
in the wasp Vespula germanica (Anderson,
1991) and ABPV in Bombus species (Bailey
and Gibbs, 1964). Our study provides further
support for this, as KBV was detected in the
same species of wasp and one of the KBV
serotypes tested was extracted from a bumblebee
from New Zealand. In terms of trade and
regulation of honeybee viruses between countries,
if these viruses exist in different insect
hosts, it makes such controls and restrictions
difficult to impose or justify. In view of this,
the full host-range of honeybee viruses warrants
further study.
At the time of sampling, all three KBV positive
UK colonies were in good condition, with
healthy numbers of adult bees and brood, however,
the colonies were infested with varroa
and one of the colonies was found to have European
foulbrood (EFB). The association of184 L. Ward et al.
Figure 1. Multiple alignment of all-available KBV sequences alongside ABPV sequences (for ABPV, if

Kết quả (Việt) 2:

184 L. Ward et al.
Hình 1. Nhiều liên kết của tất cả các trình tự có sẵn KBV cùng với chuỗi ABPV (cho ABPV, nếu
nhiều hơn một trình tự có sẵn với bản sắc 100% trong khu vực này, chỉ một trong mỗi chuỗi 'loại'
được hiển thị ), cho thấy vị trí của các đoạn mồi và đầu dò thiết kế (trong hộp). Chỉ nucleotide đa hình
được hiển thị, (.) Chỉ ra một nucleotide giống hệt nhau ở vị trí đó.
Số lượng virus KBV tại Anh và Úc
mẫu được ngoại suy từ đường cong chuẩn.
Nồng độ virus đã được bình thường hóa bằng cách chia
các log nghịch đảo của số lượng virus bằng các ngược
log của số lượng IPC ong.
3. KẾT QUẢ
3.1. Thời gian thực mồi và thiết kế đầu dò
Mặc dù KBV và ABPV được chặt chẽ
liên quan đến nó đã có thể phân biệt giữa
hai loại virus bằng cách thiết kế TaqMan
mồi và một đầu dò vào khu vực được bảo vệ của
KBV chuỗi nhưng nơi mà các chuỗi ABPV
là biến (Hình. 1, Tab. I). Các KBV khảo nghiệm
đã cho kết quả PCR dương tính khi thử nghiệm với
3 chuẩn bị rút thanh tẩy, KBV14, KBV16
và KBVNZ. Không có phản ứng chéo đã được quan sát
(không khuếch đại sau khi chu kỳ 40 PCR) khi
RNA được chiết xuất từ vi rút tinh khiết hoặc ong
bị nhiễm vi rút sau đây ABPV,
BQCV, Ngân hàng Nhà nước, CWV, SPV, DWV, Đảng và
AIV. Để xác nhận sự hiện diện của virus trong các
kính hiển vi điện tử chuẩn bị rút tinh khiết
đã được thực hiện, và trong mỗi trường hợp hạt virus
của các kích thước chính xác đã được quan sát (dữ liệu
không hiển thị). Đối với các virus tự
đã có sẵn (BQCV, Ngân hàng Nhà nước, DWV và AIV)
sự hiện diện của virus đã được xác nhận bởi RTPCR / PCR
(dữ liệu không hiển thị). Đối với cánh mây
virus (CWV) hiển vi điện tử xác nhận
sự hiện diện của các hạt virus của công đúng
kích thước, trong khi các xét nghiệm KBV đã không phát hiện virus
RNA, mặc dù các trình tự có sẵn
của CWV là giống hệt nhau để KBV. Mặc dù AIV
là một loại virus DNA nó vẫn có thể được phát hiện trong
các chiết RNA từ ong bị nhiễm độc bằng
PCR (không có một bước RT), chỉ ra rằng suf-
DNA ficient được đồng tinh chế trong việc khai thác
thủ tục để cho phép phát hiện hiệu quả.
KBV đã phát hiện thành công trong khác nhau
giai đoạn cuộc sống của Apis mellifera L. bao gồm Úc
ong mật công nhân, nhân viên nhộng và
drone nhộng. Một số công nhân ong mật
từ Mỹ cũng đã thử nghiệm dương tính với vi rút,
cùng với một con ong bắp cày Úc (Vespula Germanica).
Điều này tiếp tục cho thấy rằng các xét nghiệm
phát triển có thể phát hiện các nguồn khác nhau
của KBV trong A. mellifera cũng như KBV ở
khác nhau loài côn trùng. Phát hiện ở loài côn trùng khác
loài được hỗ trợ thêm bởi những thành công
khuếch đại của KBV trình tự từ
các KBV16 chuẩn bị virus, thu được từ một
con ong. Những con ong Đức tất cả các xét nghiệm âm tính
cho KBV, tuy nhiên, kết quả kiểm soát nội bộ
cho thấy mức độ thích đáng của tổng số RNA
đã được trích xuất (Tab. II).
3.2. Khảo sát của các thuộc địa ong mật
cho KBV
RNA chiết xuất từ 5 ong trong từng cuộc điều tra
mẫu đã được thử nghiệm với thời gian thực PCR
phát hiện đầu tiên của virus ong Kashmir ở Anh 185
Bảng II. Kết quả từ thử nghiệm được biết đến mẫu bị nhiễm bệnh và các mẫu nghi ngờ bị KBV nhiễm,
bao gồm cả số mẫu dương tính và các giá trị Ct trung bình và độ lệch chuẩn cho các KBV
khảo nghiệm trong các mẫu dương tính và xét nghiệm kiểm soát nội bộ tích cực trong tất cả các mẫu trích xuất. Các công cụ
ghi lại một giá trị Ct 40 cho các mẫu âm tính (-).
Source loại mẫu số dương Trung bình Ct cho KBV Trung bình Ct cho 18S khảo nghiệm
cá nhân được thử nghiệm mẫu dương tính với tất cả các mẫu
Úc Wasp nhộng 1/2 24,36 23,52 ± 0,18
Úc Mật ong nhân viên nhộng ong 6/6 29,09 ± 3,28 14,64 ± 0,13
Úc Mật ong ong bay không người lái nhộng 3/4 36,18 ± 1,66 14,48 ± 0,23
Úc Mật ong thợ ong 3/10 35,36 ± 6,54 16,48 ± 1,20
Úc Mật ong thợ ong 6/15 36,50 ± 1,63 23,24 ± 3,49
USA Mật ong thợ ong 2/10 31,85 ± 1,45 16,39 ± 1,55
Đức Mật ong thợ ong 0/10 - 17,59 ± 5,12
Đức Mật ong thợ ong 0/10 - 17,38 ± 0,75
xét nghiệm cho rRNA 18S ong (IPC). Sử dụng các
phương pháp chiết xuất tự động, RNA được thành công
phục hồi từ tất cả các mẫu ong. Một
hiệu quả khai thác tương tự cũng được quan sát thấy trong
tất cả các mẫu chỉ ra rằng phương pháp này là tái sản xuất.
Các trung bình real-time PCR Ct (biểu thị
bằng các điểm mà tại đó khuếch đại được
đầu tiên quan sát thấy trên ngưỡng cơ sở) giá trị
cho hai lần nhắc lại từ 458 mẫu khảo sát
là 10,39 ± 1.52.
Sau thử nghiệm bằng cách sử dụng KBV thời gian thực
nghiệm PCR, của 458 mẫu được kiểm tra, ba
dương tính với sự hiện diện của KBV. Hai
của mẫu dương tính được phát hiện tại khác nhau
tổ ong từ các nhà nuôi ong cùng. Chi tiết về
các thuộc địa được thể hiện trong hình 2. Một trong số
các thuộc địa lấy mẫu đã bị nhiễm châu Âu
foulbrood (một bệnh đáng lưu ý theo luật định)
và đã bị phá hủy như là một phần của các quốc gia
chiến lược kiểm soát bệnh. Sản phẩm PCR
AMPLI-fied trong thời gian thực nghiệm PCR đã được
nhân bản vô tính và trình tự. Trình tự của các
chuỗi sản phẩm nhân bản PCR đã được xác nhận
để được KBV sau một vụ nổ tìm kiếm trên
cơ sở dữ liệu NCBI mà phù hợp trình tự khác KBV
(đan có AY275710, AF263723-
AF263732, AY452696).
3.3. Định lượng vi rút tải Anh
mẫu ong
Lượng KBV trong dương Anh
mẫu được so sánh với ong Úc mà
đã được biết đến là nhiễm tự nhiên với KBV
ở mức thấp (không triệu chứng) hoặc mức độ cao
(có triệu chứng lâm sàng). Một tiêu chuẩn
phương pháp đường cong được sử dụng để xác định số lượng tải vi rút
trong cơ thể ong chứ không phải là phương pháp ΔCt như được mô tả
trong Chen et al. (2005). Khi tương đối
hiệu quả của con ong IPC và KBV được
vẽ như ΔCt [Ct (KBV) -Ct (IPC)], so với các bản ghi của
các pha loãng RNA, các ΔCt có một giá trị lớn
hơn 0,1 (độ dốc là 0,9513) , chỉ ra rằng
những hiệu quả khuếch đại của KBV và ong
IPC là không bằng nhau. Trong trường hợp này, các ΔCt
phương pháp không thích hợp để định lượng. Trong
Ngoài ra, là mức khởi điểm của virus và ong
IPC RNA ở các độ pha loãng tiêu chuẩn là không rõ,
tương đối chứ không phải tuyệt đối quantifi-
cation đã được sử dụng.
Một đường cong tiêu chuẩn được xây dựng bằng cách vẽ
các giá trị Ct của ong và KBV RNA chuẩn
pha loãng với nhật ký của pha loãng RNA.
Số lượng KBV và ong IPC RNA
từ mỗi con ong được ngoại suy từ các tiêu chuẩn
đường cong. Số lượng bình thường của KBV
trong mỗi con ong đã được xác định bằng cách chia
số lượng KBV RNA bởi số lượng ong
IPC RNA. Kết quả cho thấy rằng mức độ virus
trong cơ thể ong bị nhiễm bệnh từ nước Anh là tương tự
với những người ở ong với mức độ bí mật của nhiễm
từ Úc. Trong khi đó, những con ong khác
(cũng từ Úc) được cho là nhiễm rất cao,
chứa khoảng virus nhiều hơn 400 lần
so với những con ong ở các site UK Manchester và
rút hơn 100 lần so với nhiễm ngấm ngầm
ong Úc và ong Anh Hull trang web
(Hình. 3).
186 L. Ward et al.
Hình 2. Bản đồ cho thấy vị trí của 458 đàn ong lấy mẫu trong khảo sát KBV UK 2004
bao gồm hai thuộc địa mà dương tính với KBV (chỉ ra bởi những viên kim cương màu đen).
4. THẢO LUẬN
giấy này báo cáo phát hiện đầu tiên của KBV
ở Anh và cuộc điều tra quy mô lớn đầu tiên cho
virus ong ở châu Âu sử dụng công nghệ TaqMan.
Nghiên cứu này chứng tỏ các ứng dụng thực tế
của công nghệ này như một công cụ hỗ trợ
cho các cuộc điều tra và quản lý dự phòng, và
để cung cấp dữ liệu mạnh mẽ giám sát về sự hiện diện
hay không của KBV và mật ong khác
virus.
Sự kết hợp của một xét nghiệm kiểm soát nội bộ
để phát hiện các gen ong 18S rRNA cho phép
đánh giá hiệu quả khai thác và cho phép
giải thích các kết quả âm tính.
phát hiện đầu tiên của virus ong Kashmir ở Anh 187
Hình 3. Định lượng tương đối của KBV trong các mẫu ong. Đường cong (A) TaqMan Chuẩn cho vi rút KBV và
ong IPC. (B) so sánh tương đối của các cấp KBV ở ong Anh liên quan đến loài ong được biết là tự nhiên
bị nhiễm ở mức độ cao và bí mật của nhiễm KBV.
Ngoài ra, các xét nghiệm PCR thời gian thực cho phép
đánh giá định lượng nồng độ virus trong
vài bậc. Điều này được chứng minh
là có giá trị để phát hiện các bệnh nhiễm trùng-titre thấp
trong những con ong được thử nghiệm. Trong nghiên cứu này,
định lượng nồng độ KBV ở ong Anh
cho thấy chúng chứa một hàm tương tự như Úc
ong có nhiễm bí mật. Những con ong
thuộc địa từ các trang web của Anh cho thấy không rõ ràng
dấu hiệu của nhiễm virus tại thời điểm thu
cho thấy virus đã bí mật hoặc tiềm ẩn
trong những apiaries. Nó được biết rằng virus
có thể tồn tại trong con ong hoặc toàn bộ thuộc địa
trong thời gian dài mà không gây chú ý
các triệu chứng lâm sàng (Dall, 1985; Anderson và
Gibbs, 1988;. Hùng et al, 1996a, b). Các nghiên cứu
của Anderson và Gibbs (1988) đã chỉ ra rằng
nhiễm virus bí mật đã được phổ biến trong nhộng
với KBV. Các trạng thái và các trang web nơi mà các
vi rút có thể vẫn còn trong ong trong trạng thái này là
không rõ, tuy nhiên, nó đã được đề nghị
niêm mạc ruột có thể là trang web của 'unapparent'
nhiễm hay bí mật (Anderson và Gibbs,
1989). Anderson và Gibbs (1988) đã tuyên bố
rằng những nhiễm khuẩn không có một khả năng tiềm ẩn
để trở thành thành viên mới và phát triển thành cấp tính
nhiễm trùng.
Một số nghiên cứu đã cho thấy rằng virus
như KBV và ABPV có thể tồn tại như là tự nhiên
bệnh nhiễm trùng trong một phạm vi rộng lớn hơn của chi khác
hơn Apis . Ví dụ KBV đã được phát hiện
trong ong Vespula Germanica (Anderson,
1991) và ABPV trong loài Bombus (Bailey
và Gibbs, 1964). Nghiên cứu của chúng tôi cung cấp thêm
hỗ trợ cho việc này, như KBV đã được phát hiện trong
cùng một loài ong bắp cày và một trong những KBV
týp huyết thanh thử nghiệm được chiết xuất từ một ong
từ New Zealand. Về thương mại và
quy định của virus ong mật giữa các quốc gia,
nếu những loại virus tồn tại trong côn trùng khác nhau
host, nó làm cho điều khiển như thế và hạn chế
khó khăn để áp đặt hoặc biện minh. Trong quan điểm này,
các máy chủ lưu trữ đầy đủ các virus ong Warrants
nghiên cứu thêm.
Tại thời điểm lấy mẫu, cả ba KBV tích cực
các thuộc địa Anh ở trong tình trạng tốt, với
số lành mạnh của con ong trưởng thành và bố mẹ, tuy nhiên,
các thuộc địa đã bị nhiễm varroa
và một trong các thuộc địa đã được tìm thấy có châu Âu
foulbrood (EFB). Các hiệp hội of184 L. Ward et al.
Hình 1. Nhiều liên kết của tất cả các trình tự có sẵn KBV cùng với chuỗi ABPV (cho ABPV, nếu