Cloning and sequencing of rDNA ampl

Cloning and sequencing of rDNA amplicons revealed that meso- D. Ercolini / Journal of Microbiological Methods 56 (2004) 297–314 303 philic bacteria, including leuconostocs, L. lactis, and Macrococcus caseolyticus were dominant in raw milk, while S. thermophilus prevailed during the fermentation. Other rod-shaped LAB, especially L. fermentum and L. delbrueckii, were also found during ripening.The technique has also been profitably used by Cocolin et al. (2001c) to monitor the dynamic changes in bacterial community during the ripening of natural fermented Italian sausages by using DNA and RNA directly extracted from the food matrix. The region V1 of the 16S rDNA was taken into account for the analysis of the meat samples, and PCR and RT-PCR were used to obtain amplicons to be separated by DGGE. Lactic acid bacteria were found in the early stage of the ripening along with other organisms, mainly members of the family Micrococcaceae and meat contaminants, such as Brochothrix thermosphacta and Enterococcus spp. LAB represented the main population, especially Lactobacillus sake and L. curvatus, and were responsible for the acidification and proteolysis that determined the organoleptic features
of the fermented sausages, while Micrococcaceae were shown to have a restricted importance
compared to LAB. The microbial community occurring during vanilla curing in Indonesia was also studied by this approach (Ro¨ling et al., 2001). The authors found a significant occurrence of Bacillus isolates and also highlighted the presence of unculturable microorganisms during
the high-temperature phases of the bean curing. Drinks may also benefit from this type of investigation for both fermented and nonfermented beverages. LAB communities existing during the fermentation of Malt whisky were monitored by van Beek and Priest (2002) by PCR-DGGE of V3 and RT-PCR-DGGE of V6–V8 regions of 16 rDNA coupled with traditional isolation procedure, viable staining counts, and scanning electron microscopy. The authors showed that mainly lactobacilli played an important role in the fermentation and that homofermentative Lactobacillus acidophilus and L. crispatus dominated the last phase of the fermentation. van Beek and Priest (2002) also optimized the separation of lactobacilli in DGGE by adopting the V6–V8 region of 16S rDNA as a target, giving better resolution of several species due to higher heterogeneity in sequence among species of the genus Lactobacillus. Among microbial food processes, dough leavening
by using sourdoughs as starter is often employed, yielding appreciated bakery products. Recently, sourdough fermentation performed by different starters was monitored by using Lactobacillus group-specific 16S rDNA primers in PCR followed by DGGE analysis (Meroth et al., 2003). Shifts of Lactobacillus population during the fermentation of each dough could be determined and the dominant species carrying out the process up to the end were identified as Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus pontis, Lactobacillus mindensis, L. crispatus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus frumenti, and Lactobacillus reuteri, depending on the type of starter used.
6. Identification of members of the cultivable community: an alternative to isolation
The PCR-DGGE can be also used to rapidly check the diversity of the bacterial community after cultivation in liquid or solid and specific or nonspecific culture media. Briefly, after colony counting has been performed, the colonies from the plates can be collected in ‘‘bulks’’ and subjected to DNA extraction and PCR-DGGE analysis (Ercolini et al., 2001b). Consequently, a DGGE fingerprint can be obtained for each plate, each dilution, and culture medium. This method to investigate the cultivable microbial community has been shown to have good potential in food microbiology. Firstly, it provides an alternative to traditional tools for the identification of dominant species. Qualification of the dominant species could be achieved by sequencing the DGGE bands arising from the patterns corresponding to the highest dilutions in spite of the isolation of single colonies followed by purification and biochemical identification. The bulk from countable plates can be thus used to identify dominant microbial species from the food matrix as performed by Ercolini et al. (2003a) in analysing the Stilton cheese. The advantage is that, while sequencing of partial 16S rDNA fragments represents a sound tool for identifying species, identification of species using phenotypic methods such as sugar fermentation patterns may sometimes be uncertain, complicated, and time-consuming, particularly within LAB, due to an increasing number of species that vary in a few traits (Quere et al., 1997).

Kết quả (Việt) 2:

Nhân bản và trình tự rDNA amplicon tiết lộ rằng meso- D. Ercolini / Tạp chí Phương pháp vi sinh 56 (2004) 297-314 303 vi khuẩn philic, bao gồm leuconostocs, L. lactis, và Macrococcus caseolyticus chiếm ưu thế trong sữa nguyên liệu, trong khi S. thermophilus thắng trong quá trình lên men. Khác hình que LAB, đặc biệt là L. fermentum và L. delbrueckii, cũng được tìm thấy trong nho chín kỹ thuật cũng đã được lợi nhuận được sử dụng bởi Cocolin et al. (2001c) để theo dõi những thay đổi năng động trong cộng đồng vi khuẩn trong quá trình chín của xúc xích Ý lên men tự nhiên bằng cách sử dụng DNA và RNA trực tiếp chiết xuất từ các ma trận thực phẩm. Các V1 khu vực của 16S rDNA được đưa vào tài khoản cho các phân tích của các mẫu thịt, và PCR và RT-PCR được sử dụng để có được amplicon được phân cách bằng DGGE. Vi khuẩn axit lactic đã được tìm thấy trong giai đoạn đầu của quá trình chín cùng với các sinh vật khác, chủ yếu là các thành viên của gia đình Micrococcaceae và chất gây ô nhiễm thịt, như Brochothrix thermosphacta và Enterococcus spp. LAB đại diện cho dân số chính, đặc biệt là vì lợi ích Lactobacillus và L. curvatus, và chịu trách nhiệm cho quá trình axit hóa và phân giải protein trong đó xác định các đặc tính cảm quan
của xúc xích lên men, trong khi Micrococcaceae đã được chứng minh là có một tầm quan trọng hạn chế
so với LAB. Các cộng đồng vi khuẩn xảy ra trong quá trình đóng rắn vani ở Indonesia cũng đã được nghiên cứu bằng phương pháp này (Röling et al., 2001). Các tác giả nhận thấy một sự xuất hiện đáng kể của các chủng Bacillus và cũng nhấn mạnh sự hiện diện của vi sinh vật không nuôi cấy trong
các giai đoạn nhiệt độ cao của bảo dưỡng đậu. Đồ uống cũng có thể hưởng lợi từ loại này điều tra cho cả hai loại đồ uống lên men và nonfermented. Cộng đồng LAB hiện trong quá trình lên men của Malt whisky đã được theo dõi bởi van Beek và Priest (2002) bằng phương pháp PCR-DGGE của V3 và RT-PCR-DGGE của vùng V6-V8 của 16 rDNA cùng với thủ tục cách ly truyền thống, đếm nhuộm khả thi, và kính hiển vi điện tử quét. Các tác giả cho thấy chủ yếu là lactobacilli đóng một vai trò quan trọng trong quá trình lên men và Lactobacillus acidophilus và L. homofermentative crispatus thống trị giai đoạn cuối cùng của quá trình lên men. van Beek và Priest (2002) cũng được tối ưu hóa việc tách lactobacilli trong DGGE bằng cách áp dụng các khu vực V6-V8 16S rDNA như là một mục tiêu, cho độ phân giải tốt hơn của một số loài do tính không đồng nhất cao hơn trong chuỗi giữa các loài Lactobacillus. Trong quá trình thực phẩm vi sinh vật, bột nở bột
bằng cách sử dụng sourdoughs như khởi động thường được làm việc, năng suất sản phẩm bánh mì đánh giá cao. Gần đây, bột chua lên men được thực hiện bởi người mới bắt đầu khác nhau đã được theo dõi bằng cách sử dụng Lactobacillus nhóm cụ thể mồi 16S rDNA trong PCR sau đó phân tích DGGE (Meroth et al., 2003). Sự thay đổi của dân số Lactobacillus trong quá trình lên men của mỗi bột có thể được xác định và các loài ưu thế thực hiện quá trình lên để cuối cùng được xác định là Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus PONTIS, Lactobacillus mindensis, L. crispatus, johnsonii Lactobacillus, Lactobacillus frumenti, và Lactobacillus reuteri , tùy thuộc vào loại khởi động sử dụng.
6. Xác định các thành viên của cộng đồng canh tác: một thay thế cho cách ly
PCR-DGGE cũng có thể được sử dụng để nhanh chóng kiểm tra sự đa dạng của cộng đồng vi khuẩn sau khi trồng trong môi trường nuôi cấy lỏng hoặc rắn và cụ thể hoặc không đặc hiệu. Một thời gian ngắn, sau khi thuộc địa đếm đã được thực hiện, các thuộc địa từ các tấm có thể được thu thập trong '' bulks '' và bị tách chiết DNA và phân tích PCR-DGGE (Ercolini et al., 2001b). Do đó, một dấu vân tay DGGE có thể thu được cho mỗi tấm, mỗi pha loãng, và môi trường nuôi cấy. Phương pháp này để điều tra các cộng đồng vi khuẩn có thể canh tác đã được chứng minh là có tiềm năng tốt về vi sinh thực phẩm. Thứ nhất, nó cung cấp một thay thế cho công cụ truyền thống cho việc xác định các loài ưu thế. Trình độ chuyên môn của các loài ưu thế có thể đạt được bằng cách sắp xếp các băng DGGE phát sinh từ các mẫu tương ứng với các độ pha loãng cao nhất bất chấp sự cô lập của các thuộc địa duy nhất tiếp theo là thanh lọc và xác định sinh hóa. Các số lượng lớn từ tấm đếm được có thể được như vậy được sử dụng để xác định loài vi sinh vật chiếm ưu thế từ các ma trận thực phẩm được thực hiện bởi Ercolini et al. (2003a) trong việc phân tích các pho mát Stilton. Ưu điểm là, trong khi trình tự của một phần mảnh 16S rDNA đại diện cho một công cụ âm thanh để xác định loài, xác định các loài sử dụng phương pháp kiểu hình như mô hình lên men đường đôi khi có thể không chắc chắn, phức tạp, và tốn thời gian, đặc biệt là trong LAB, do một tăng số lượng của các loài khác nhau về một vài tính trạng (Quere et al., 1997).