Fig 7. Anti-HSV-1 CRISPR gRNAs are

Fig 7. Anti-HSV-1 CRISPR gRNAs are ineffective in targeting quiescent HSV-1 but do abrogate replication of reactivated HSV-1.
a) MRC5 cells exogenously expressing Cas9 were infected with quiescent HSV-1-eGFP. Anti-HSV-1 gRNAs were introduced into the MRC5-Cas9 cells via lentiviral transduction and cells were subsequently superinfected with HCMV to reactivate latent HSV-1. The percentage of cells with replicating HSV-1 were assessed 3 days post HCMV superinfection by flow cytometry. Two quiescent control (‘cells alone’) samples are presented: one not superinfected with HCMV to assess spontaneous HSV-1 reactivation levels, and one superinfected with HCMV to assess the reactivation potential and subsequent HSV-1 replication in these cells. Control vector corresponds to empty gRNA-vector. b) Relative amount of HSV-1 genomes in quiescent HSV-1-eGFP cells transduced with the indicated gRNAs as assessed by TaqMan qPCR. DNA input was normalized to RNAseP levels. The relative HSV-1 content was compared to quiescent MRC5 cells transduced with empty vector control lentivirus. c) Analysis of anti-HSV-1 genome editing by next generation sequencing. The percentage of WT sequences at the indicated target sites is presented upon introduction of the corresponding gRNA. For UL8 and UL52, two samples were analyzed. In control vector treated quiescent HSV-1 cells, no CRISPR/Cas9 editing was observed at these target sites (gRNA specific indels

Kết quả (Việt) 1:

Hình 7. Anti-HSV-1 CRISPR gRNAs là không hiệu quả trong nhắm mục tiêu quiescent HSV-1 nhưng thay bỏ các bản sao của tái HSV-1.a) MRC5 tế bào exogenously thể hiện Cas9 đã bị nhiễm quiescent HSV-1-eGFP. Anti-HSV-1 gRNAs đã được giới thiệu vào các tế bào MRC5-Cas9 via lentiviral dẫn truyền và tế bào sau đó đã được superinfected với HCMV để kích hoạt lại tiềm ẩn HSV-1. Tỷ lệ phần trăm tế bào với sao chép HSV-1 đã là đánh giá ngày 3 bài HCMV bội của dòng chảy cytometry. Hai mẫu quiescent điều khiển ('tế bào một mình') được trình bày: một không superinfected với HCMV để đánh giá tự phát HSV-1 kích hoạt cấp độ, và một superinfected với HCMV để đánh giá các kích hoạt tiềm năng và sau đó HSV-1 bản sao trong các tế bào. Kiểm soát véc tơ tương ứng với gRNA-vector trống rỗng. b) tương đối số HSV-1 bộ gen trong tế bào HSV-1-eGFP quiescent transduced với gRNAs được chỉ định như đánh giá bởi TaqMan qPCR. Đầu vào DNA được chuẩn hoá đến mức độ RNAseP. Nội dung tương đối của HSV-1 được so sánh với các tế bào MRC5 quiescent transduced với lentivirus kiểm soát véc tơ có sản phẩm nào. c) phân tích các anti-HSV-1 gen chỉnh sửa bởi tiếp theo thế hệ trình tự. Tỷ lệ phần trăm của WT chuỗi tại các trang web chỉ định mục tiêu được trình bày theo giới thiệu của gRNA tương ứng. Đối với UL8 và UL52, hai mẫu được phân tích. Kiểm soát véc tơ đối xử quiescent HSV-1 tế bào, không có chỉnh sửa CRISPR/Cas9 được quan sát thấy tại các trang web mục tiêu (gRNA cụ thể indels < 0,1%). Bộ gen CRISPR/Cas9 chỉnh sửa chỉ được quan sát cho UL52 #2 và UL8 #2 nơi CRISPR/Cas9 chỉnh sửa đổi rõ ràng trong ±6 và ±1% các chuỗi. Bản chất của những đột biến được trình bày trong hình S4.

Kết quả (Việt) 2:

GRNAs Hình 7. Anti-HSV-1 CRISPR là không hiệu quả trong mục tiêu hoạt động gì HSV-1 nhưng bỏ nhân rộng kích hoạt HSV-1.
A) MRC5 tế bào exogenously bày tỏ Cas9 bị nhiễm tĩnh HSV-1-EGFP. GRNAs chống HSV-1 đã được đưa vào tế bào MRC5-Cas9 qua truyền lentivirus và các tế bào sau đó được superinfected với HCMV để kích hoạt lại tiềm ẩn HSV-1. Tỷ lệ phần trăm của các tế bào với sao chép HSV-1 được đánh giá 3 ngày sau HCMV bội bởi dòng cytometry. Hai ( 'tế bào một mình') Kiểm soát hoạt động gì mẫu được trình bày: một không superinfected với HCMV để đánh giá mức độ kích hoạt HSV-1 tự phát, và một superinfected với HCMV để đánh giá tiềm năng kích hoạt và sau đó HSV-1 nhân rộng trong các tế bào. Vector kiểm soát tương ứng với sản phẩm nào gRNA-vector. b) số lượng tương đối của HSV-1 gen trong các tế bào HSV-1-EGFP tĩnh tải nạp với gRNAs chỉ theo đánh giá của TaqMan qPCR. Đầu vào DNA đã được bình thường đến mức RNAseP. Các tương đối nội dung HSV-1 được so sánh với các tế bào MRC5 tĩnh tải nạp với trống lentivirus điều khiển vector. c) Phân tích chống HSV-1-chỉnh sửa hệ gen bằng cách trình tự thế hệ tiếp theo. Tỷ lệ phần trăm của các chuỗi WT tại địa điểm mục tiêu chỉ định được xuất trình khi giới thiệu của gRNA tương ứng. Đối với UL8 và UL52, hai mẫu được phân tích. Trong điều khiển vector điều trị tĩnh tế bào HSV-1, không có CRISPR / Cas9 chỉnh sửa đã được quan sát thấy ở các trang web mục tiêu (indels cụ gRNA <0,1%). CRISPR / Cas9 chỉnh sửa gen được chỉ quan sát cho UL52 # 2 và # 2 UL8 nơi CRISPR / Cas9 chỉnh sửa là rõ ràng trong ± 6 và ± 1% trình tự. Bản chất của những đột biến này được trình bày trong Hình S4.