Evaluation of Quantitative Analysis

Evaluation of Quantitative Analysis of Flavonoid Aglycones in Ginkgo biloba Extract and Its Products

LIN-CHIN, YI-RONG LIN, CHENG-YU HUANG AND KUO-CHING WEN*

National Laboratories of Foods and Drugs, Department of Health, Executive Yuan, 161-2, Kuen Yang Street, Nankang 115, Taipei, Taiwan, R.O.C.

(Received: December 31, 1999; Accepted: May 1, 2000)

ABSTRACT

A simple and rapid HPLC method was developed to evaluate and validate the assay of quercetin, kaempferol and isorhamnetin in Ginkgo biloba extract and its products. The column used is Cosmosil 5C18-AR, and mobile phase is MeOH:0.3%H3PO4 (1:1). The corre- lation coefficients of linear calibration for quercetin, kaempferol and isorhamnetin are 0.9999, 0.9999, and 0.9989, respectively. The rela- tive standard deviations of intra-day assays for quercetin, kaempferol, and isorhamnetin are 0.29%, 0.28%, and 1.90%, respectively; inter- day assays are 0.95%, 0.85%, and 1.67%, respectively. The recoveries of quercetin, kaempferol and, isorhamnetin are 87.4%, 94.0%, and
72.4%, respectively. The optimal condition for acid hydrolysis of flavonoid glycosides in Ginkgo biloba extract could be achieved by refluxing with 20.0% HCl at 85˚C for 15 min or with 5.5% HCl at the same temperature for 30 min.

Key words: Ginkgo biloba extract, HPLC, quercetin, kaempferol, isorhamnetin


INTRODUCTIOM

Ginkgo Semen is the seed of Ginkgo biloba L. and clas- sified in Ginkgoaceae. Dried Ginkgo Semen was used as a traditional Chinese medicine with a common name “bai- guo”. The components in bai-guo include proteins, lipids, and carbohydrates. Apart from Chinese, the Westerners have also used Ginkgo biloba leaf extract as a medicine. Flavonoid glycosides and terpene lactones (including ginkgolides and bilobalides) are two main groups of active components in Ginkgo biloba leaf. Based on the literature(1-5) and the mono- graph reported by specialists in commission E of the Federal Institute for Drugs and Medical Devices of Germany, the medical functions of Ginkgo biloba include (1) improvement of hypoxic tolerance, particularly in cerebral tissue (2) inhi- bition of the development of traumatically or toxically induced cerebral edema and acceleration of its regression; (3) inactivation of toxic oxygen radicals (flavonoids); (4) antag- onism of the platelet-activating factor (PAF) by ginkgolides; (5) protecting nerves by ginkgolides A and B and bilobalides.
Since Ginkgo biloba was proven to improve blood cir- culation of capillaries and cerebrum, recently it was manu- factured into various products such as tablet, sugar-coated tablet, film-coated tablet, oral solution, drop, and injection. Therefore, the cases for registering Ginkgo biloba extract and its derived products are increasing in Taiwan. To date, flavonoids in these products are the only components that are requested to assay by the manufacturers. The analysis of flavonoids can be achieved by UV and HPLC methods. However, due to variations in rationale and detecting com- pound between these two methods, the calculation and quan- titation are expressed in different ways.

* Author for correspondence. Tel: [phone];
Fax: [phone]; E-mail: [e-mail]

The UV method used quercetin as the reference stan- dard. The samples were hydrolyzed, reacted with AlCl3 to form color, and then quantified with UV spectrophotometer. Since the factor used to calculate the total flavonoids was not a constant, the deviation of this method is always large. In addition, proanthocyanidines in samples could interfere with detection and reduce the reproducibility of the results. Furthermore, the UV method was not specific(4) and was gradually replaced by HPLC method. For this reason and the suggestion of the National Laboratory of Foods and Drugs, the Department of Health of Taiwan has stated in ordinance
1995.11.1.(7) that HPLC method is a recommended method
to examine the components in raw material of Ginkgo biloba
leaf extract and its derived products.
Using quercetin, kaempferol and isorhamnetin as the reference standards for HPLC method, the samples were hydrolyzed and then analyzed by HPLC. Although five kinds of C18 columns used to analyze flavonoids have been evalu- ated and reported(5), this currently developed method is, however, different from those reported and official methods in sample pre-treatment, column and mobile phase choices, detection wavelength, and flow rate of the mobile phase. Thus, the objective of this research is to re-evaluate HPLC method used to quantify quercetin, kaempferol, and isorham- netin in Ginkgo biloba leaf extract and its derived products
and to develop an optimum separation and quantification method. This research also studied the hydrolysis condition of flavonoid glycosides, selection of the HPLC column and mobile phase, repeatability of analyses, and recovery of each standard compound. This developed method was evaluated using commercial Ginkgo biloba products as the testing com- pounds in order to establish an official method to analyze flavonoids in these products.


Journal of Food and Drug Analysis, Vol. 8, No. 4, 2000


MATERIALS AND METHODS

I. Instruments

HITACI HPLC equipped with a L-7100 pump and a L-
7400 detector.

II. HPLC Columns

1. Cosmosil 5C18-AR (4.6  150 mm, 5µ m) (Waters, Milford, MA, USA)
2. LiChrospher 100RP-18 (4.0  125 mm, 5 µ m) (Merck,
Hohenbrunn, German)
3. µ -Bondapak C18 (3.9  300 mm, 10 µ m) (Waters, Milford, MA, USA)
4. Inertsil ODS-2 (4.6  250 mm, 5 µ m) (GL Science, Kyoto,
Japan)
5. Cosmosil 5C18-MS (4.6  150 mm, 5 µ m) (Waters, Milford, MA, USA)
6. SYMETRY (4.6  150 mm, 5 µ m) (Waters, Milford, MA,
USA)
7. Nucleosil 5C18 (4.6  150 mm, 5 µ m) (Phenomenex, Torrance, CA, USA)
8. Hypersil 5C18 (4.6  150 mm, 5 µ m) (Phenomenex,
Torrance, CA, USA)
9. PRODIGY 5 ODS-2 (4.6  250 mm, 5 µ m) (Phenomenex, Torrance, CA, USA)

III. Standard Compounds and Reagents

(I) Standard Compounds

Quercetin, kaempferol, and isorhamnetin were pur- chased from EXTRA SYNTHESE Co. (Genay, France). Morin was from NACALAI Co. (Kyoto, Japan).

(II) Reagents

Na2HPO4•12H2O, NaH2PO4•2H2O, and KH2HPO4 were from WAKO Co. (Osaka, Japan); sodium 1-octanesulfonate (PICB8) was from SIGMA Co. (St. Louis, MO, USA); phos- phoric acid and acetic acid were from Merck Co. (Hohenbrunn, Germany).

(III) Solvents

Methanol and acetonitrile were obtained from LAB- SCAN Co. (Dublin, Ireland); tertrahydrofuran (THF) was from Merck Co. All solvents were HPLC grade.

(IV) Samples

Ginkgo biloba extract was purchased from Tradshine Co. Ltd. (imported from Boral Quimica, S.A., Spain). Twelve commercial available Ginkgo biloba products includes 8 samples of film-coated tablets and one sample of sugar-coat- ed tablet, tablet, drop, and oral solution.

IV. Methods

(I) Study of the HPLC Conditions

1. Selection of the Mobile Phase

Nine different mobile phases were evaluated to separate quercetin, kaempferol, and isorhamnetin, and Cosmosil 5C18- MS column was used as the HPLC column. The retention time (tR), relative retention (), and resolution (Rs) resulted from various mobile phases were compared, and the most appropriate mobile phase could be selected.

2. Selection of HPLC Column

Nine HPLC columns with methanol:0.3% H3PO4 (1:1) as the mobile phase were evaluated to analyze quercetin, kaempferol, and isorhamnetin. The retention time (tR), asym- metry of peaks (As), resolution (Rs), and plate number (N) obtained from different columns were compared, and the best column could be chosen.

(II) HPLC Analysis of Commercial Products

1. Preparation of the Commercial Products for HPLC Analysis

Four to five sample tablets (or 5.0 mL for liquid sample) were ground and 20 mL 80% methanol solution was added to dissolve the sample. After shaking for 30 min, the mixture was placed aside until two phases were separated. Ten mL of the upper layer was removed and treated with 10 mL 5.5% HCl solution. The solution was refluxed in 85˚C water bath for 30 min. Finally the solution was filtered and ready for HPLC analysis.

2. HPLC Conditions

Column, Cosmosil 5C18-AR (150 mm); mobile phase, methanol:0.3% H3PO4 (1:1); flow rate, 1.0 mL/min; detec- tion wavelength, 370 nm.

(III) Standard Curves of Quercetin, Kaempferol, and
Isorhamnetin

Quercetin, kaempferol, isorhamnetin, and morin (inter- nal standard) were measured precisely and were dissolved separately in 80% methanol solution. Quercetin solution was further diluted to 500, 110, 53, and 26 µ g/mL; kaempferol solution to 470, 100, 50, and 25 µ g/mL; isorhamnetin solu- tion to 270, 54, 27, and 13 µ g/mL. Internal standard (44
µ g/mL) was spiked into each dilution, which was then ana- lyzed by HPLC. The standard curves were obtained by plot- ting the peak area ratios (Y-axis) of standard compounds to the internal standard versus the concentrations of standard compound (X-axis). According to these standard curves, the linear regressions (Y = mX + b) and correlation coefficients


Journal of Food and Drug Analysis, Vol. 8, No. 4, 2000


were computed.

(IV) Investigation of Hydrolysis Conditions

1. Concentration of HCl

Ten mL of different concentrations of methanolic HCl solution (2.25%, 5.5%, 10%, 20%, and 25%) were added to five tubes (10 mL each) of diluted Ginkgo biloba extract (1.5 g sample dissolved in 200 mL 80% methanol solution) sepa- rately. Each mixture was refluxed in an 85˚C water bath for
30 min, after cooling, each mixture was spiked with internal standard. Finally, the volume was brought to 25 mL with
80% methanol solution and then was analyzed by HPLC. The
HPLC conditions were the same as described above.

2. Hydrolysis Time

Ten mL of HCl solution (20%) was added into 4 tubes of diluted Ginkgo biloba extract (10 mL each), and each mix- ture was refluxed in a water bath (85˚C) for 15, 30, 60, and
120 min, respectively. After cooling, each mixture was spiked with I.S. and brought to 25 mL with 80% methanol soluti

Kết quả (Việt) 1:

Đánh giá phân tích định lượng của Flavonoid Aglycones ở Ginkgo biloba chiết xuất và các sản phẩm của nóLIN-CHIN, YI-RONG LIN, HUANG CHENG-YU VÀ KUO-CHING WEN *Phòng thí nghiệm quốc gia của thực phẩm và thuốc, sở y tế, giám đốc điều hành nhân dân tệ, 161-2, Kuen Yang Street, Nankang 115, Đài Bắc, Đài Loan, R.O.C.(Nhận được: 31 tháng 12 năm 1999; Chấp nhận: Ngày 1 tháng 5 năm 2000)TÓM TẮTMột phương pháp đơn giản và nhanh chóng hệ HPLC được phát triển để đánh giá và xác nhận các khảo nghiệm của quercetin, kaempferol và isorhamnetin ở Ginkgo biloba chiết xuất và sản phẩm của mình. Cột được sử dụng là Cosmosil 5C 18-AR, và giai đoạn di động là MeOH:0.3%H3PO4 (1:1). Hệ số corre-lation của tuyến tính hiệu chuẩn cho quercetin, kaempferol và isorhamnetin là 0.9999, 0.9999, và 0.9989, tương ứng. Độ lệch chuẩn rela-hoạt động cùng của nội ngày thử nghiệm cho quercetin, kaempferol và isorhamnetin là 0,29%, 0,28% và 1,90%, tương ứng; Inter-ngày thử nghiệm là 0,95%, 0,85% và 1,67%, tương ứng. Phục hồi của quercetin, kaempferol, và isorhamnetin là 87,4%, 94,0%, vàhoàn thành đến 72,4%, tương ứng. Các điều kiện tối ưu cho thủy phân axit của flavonoid glicozit ở Ginkgo biloba chiết xuất có thể đạt được bởi refluxing với 20.0% HCl tại 85˚C trong 15 phút hoặc với 5,5% HCl ở nhiệt độ cùng cho 30 phút.Từ khóa: Ginkgo biloba trích xuất, hệ HPLC, quercetin, kaempferol, isorhamnetin INTRODUCTIOMBạch quả tinh dịch là hạt giống của Ginkgo biloba L. và cổ-sified ở Ginkgoaceae. Khô Ginkgo tinh dịch được sử dụng như một loại thuốc truyền thống Trung Quốc với một tên gọi "bai-Quách". Các thành phần trong bài-Quách bao gồm protein, chất béo và carbohydrate. Ngoài Trung Quốc, các người phương Tây cũng đã sử dụng Ginkgo biloba lá giải nén như một loại thuốc. Flavonoid glicozit và terpene lacton (bao gồm cả ginkgolides và bilobalides) là hai nhóm chính của các phần tử hoạt năng Ginkgo biloba lá. Dựa trên literature(1-5) và đồ thị mono báo cáo của các chuyên gia trong Ủy ban E của viện liên bang cho thuốc và thiết bị y tế Đức, các chức năng y tế của Ginkgo biloba bao gồm (1) cải thiện hypoxic khoan dung, đặc biệt là trong mô não (2) inhi-bition của sự phát triển của traumatically hoặc toxically gây ra não phù và gia tốc của hồi quy của nó; (3) ngừng hoạt động của các gốc do độc hại oxy (flavonoid); (4) antag-onism của các yếu tố kích hoạt tiểu cầu (PAF) bởi ginkgolides; (5) bảo vệ dây thần kinh của ginkgolides A và B và bilobalides.Kể từ khi Ginkgo biloba đã được chứng minh để cải thiện máu cir-culation của Mao mạch và nao, óc, gần đây nó đã manu-factured vào các sản phẩm khác nhau như máy tính bảng, bọc đường tablet, tablet phim, uống giải pháp, thả và tiêm. Do đó, các trường hợp đăng ký Ginkgo biloba giải nén và sản phẩm có nguồn gốc của mình đang gia tăng tại Đài Loan. Đến nay, flavonoid trong các sản phẩm này là những thành phần duy nhất được yêu cầu để khảo nghiệm của các nhà sản xuất. Phân tích của flavonoid có thể đạt được bằng phương pháp UV và hệ HPLC. Tuy nhiên, do thay đổi trong lý do và phát hiện com-pound giữa hai phương pháp, tính toán và quận-titation được thể hiện trong nhiều cách khác nhau.* Tác giả cho thư. Điện thoại: [phone];Fax: [phone]; Thư điện tử: [e-mail] Phương thức UV dùng quercetin như stan tham khảo-Sở NN & PTNT. Các mẫu được thủy phân đạm, phản ứng với AlCl3 để hình thức màu, và sau đó định lượng với UV phối. Kể từ khi các yếu tố được sử dụng để tính toán các flavonoid tất cả đã không một hằng số, độ lệch của phương pháp này là luôn luôn lớn. Ngoài ra, proanthocyanidines trong các mẫu có thể can thiệp với phát hiện và giảm reproducibility kết quả. Hơn nữa, phương pháp UV đã không specific(4) và dần dần được thay thế bằng hệ HPLC phương pháp. Đối với lý do này và đề nghị của quốc gia phòng thí nghiệm thực phẩm và thuốc, sở y tế của Đài Loan đã nêu trong pháp lệnh1995.11.1.(7) rằng hệ HPLC phương pháp là một phương pháp được đề nghịđể kiểm tra các thành phần nguyên liệu của Ginkgo bilobalá chiết xuất và các sản phẩm có nguồn gốc.Sử dụng quercetin, kaempferol và isorhamnetin là các tiêu chuẩn tài liệu tham khảo cho hệ HPLC phương pháp, các mẫu đã được thủy phân đạm và sau đó phân tích hệ HPLC. Mặc dù năm loại C18 cột được sử dụng để phân tích flavonoid có là evalu-ated và reported(5), hiện đang phát triển phương pháp này là, Tuy nhiên, khác với những phương pháp báo cáo và chính thức trong mẫu trước khi điều trị, cột và điện thoại di động giai đoạn lựa chọn, bước sóng phát hiện, và tốc độ dòng chảy của giai đoạn di động. Vì vậy, mục tiêu của nghiên cứu này là để đánh giá lại hệ HPLC phương pháp được sử dụng để định lượng quercetin, kaempferol, và isorham-netin trong Ginkgo biloba lá chiết xuất và các sản phẩm từ dẫn xuấtvà để phát triển một phương pháp tối ưu ly thân và định lượng. Nghiên cứu này cũng nghiên cứu điều kiện thủy phân của flavonoid glicozit, lựa chọn của hệ HPLC cột và giai đoạn di động, độ phân tích, và phục hồi của mỗi tiêu chuẩn hợp chất. Phương pháp phát triển này được đánh giá bằng cách sử dụng thương mại Ginkgo biloba sản phẩm như com-Pao thử nghiệm để tạo ra một phương pháp chính thức để phân tích flavonoid trong các sản phẩm. Tạp chí thực phẩm và phân tích ma túy, Vol. 8, số 4, 2000 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPI. cụHệ HPLC HITACI trang bị với một máy bơm L-7100 và một L-Máy dò 7400.II. hệ HPLC cột1. Cosmosil 5C 18-AR (4,6  150 mm, 5µ m) (nước, Milford, MA, Hoa Kỳ)2. LiChrospher 100RP 18 (cách 4.0  125 mm, 5phút µ) (Merck,Hohenbrunn, Đức)3. µ - Bondapak C18 (cách 3.9  300 mm, 10phút µ) (Waters, Milford, MA, Hoa Kỳ)4. Inertsil ODS-2 (cách 4.6  250 mm, 5phút µ) (khoa học GL, Kyoto,Nhật bản)5. Cosmosil 5C 18-MS (cách 4.6  150 mm, 5 µ m) (nước, Milford, MA, Hoa Kỳ)6. SYMETRY (cách 4.6  150 mm, 5 µ m) (nước, Milford, MA,HOA KỲ)7. Nucleosil 5 c 18 (cách 4.6  150 mm, 5phút µ) (Phenomenex, Torrance, California, Hoa Kỳ)8. Hypersil 5 c 18 (cách 4.6  150 mm, 5phút µ) (Phenomenex,Torrance, CA, Hoa Kỳ)9. thần đồng 5 ODS-2 (cách 4.6  250 mm, 5phút µ) (Phenomenex, Torrance, California, Hoa Kỳ)III. tiêu chuẩn hợp chất và hoá chất(I) tiêu chuẩn hợp chấtQuercetin, kaempferol và isorhamnetin là pur-đuổi từ phụ SYNTHESE Co. (Genay, Pháp). Morin là từ NACALAI Co. (Kyoto, Nhật bản).(II) thuốc thửNa2HPO4•12H2O, NaH2PO4•2H2O, và KH2HPO4 đã từ WAKO Co. (Osaka, Nhật bản); Natri 1-octanesulfonate (PICB8) là từ SIGMA Co. (St. Louis, MO, Hoa Kỳ); Phos-phoric acid và axit axetic từ Merck Co. (Hohenbrunn, Đức).(III) dung môiMethanol và acetonitrile đã thu được từ phòng thí nghiệm-quét công (Dublin, Ireland); tertrahydrofuran (THF) là từ Merck công Tất cả các dung môi là hệ HPLC lớp.(IV) mẫuGinkgo biloba chiết xuất được mua từ Tradshine Co. Ltd. (nhập khẩu từ Boral Quimica, S.A., Tây Ban Nha). Mười hai thương mại có sẵn Ginkgo biloba sản phẩm bao gồm 8 mẫu của phim và một trong những mẫu của đường-áo-ed viên thuốc, viên thuốc, thả, và giải pháp bằng miệng. IV. phương pháp(I) nghiên cứu của các điều kiện hệ HPLC1. lựa chọn của giai đoạn điện thoại di động9 giai đoạn khác nhau điện thoại di động đã được đánh giá để tách quercetin, kaempferol và isorhamnetin, và Cosmosil 5 c 18-MS cột được sử dụng như là cột HPLC. Thời gian lưu giữ (tR), tương đối lưu giữ (), và độ phân giải (Rs) phát sinh từ nhiều điện thoại di động giai đoạn đã được so sánh, và giai đoạn di động thích hợp nhất có thể được lựa chọn.2. sự lựa chọn của hệ HPLC cộtChín HPLC cột với methanol:0.3% H3PO4 (1:1) là giai đoạn điện thoại di động đã được đánh giá để phân tích các quercetin, kaempferol, và isorhamnetin. Thời gian lưu giữ (tR), asym-metry của đỉnh núi (là), độ phân giải (Rs), và bảng số (N) thu được từ cột khác nhau đã được so sánh, và cột tốt nhất có thể được chọn.(II) hệ HPLC phân tích các sản phẩm thương mại1. chuẩn bị các sản phẩm thương mại cho hệ HPLC phân tích4-5 máy tính bảng mẫu (hoặc 5.0 mL cho lỏng mẫu) là đất và 20 mL 80% methanol giải pháp đã được bổ sung để hòa tan mẫu. Sau lắc trong 30 phút, hỗn hợp đã được đặt sang một bên cho đến khi hai giai đoạn đã được tách ra. 10 mL của lớp trên đã được gỡ bỏ và điều trị bằng 10 mL 5,5% HCl giải pháp. Giải pháp refluxed trong 85˚C nước tắm cho 30 phút. Cuối cùng các giải pháp đã được lọc và sẵn sàng cho hệ HPLC phân tích.2. hệ HPLC điều kiệnCột, Cosmosil 5C 18-AR (150 mm); điện thoại di động giai đoạn, methanol:0.3% H3PO4 (1:1); tốc độ dòng chảy, 1.0 mL/phút; bước sóng detec-tion, 370 nm.(III) tiêu chuẩn đường cong của Quercetin, Kaempferol, vàIsorhamnetinQuercetin, kaempferol, isorhamnetin, và morin (inter nal tiêu chuẩn) được đo chính xác và bị giải tán một cách riêng biệt trong 80% methanol giải pháp. Quercetin giải pháp tiếp tục được pha loãng đến 500, 110, 53, và 26 µ g/mL; kaempferol giải pháp để 470, 100, 50, và 25 µ g/mL; isorhamnetin solu-tion 270, 54, 27, và 13 µ g/mL. Nội bộ tiêu chuẩn (44µ g/mL) được tăng vọt vào mỗi pha loãng, sau đó là ana-lyzed bởi hệ HPLC. Các đường cong tiêu chuẩn đã được thu được bằng cốt truyện-ting các tỷ lệ tích cao điểm (trục) của các hợp chất tiêu chuẩn để các tiêu chuẩn nội bộ so với nồng độ của tiêu chuẩn hợp chất (trục x). Theo những đường cong tiêu chuẩn, regressions tuyến tính (Y = mX + sinh) và hệ số tương quan Tạp chí thực phẩm và phân tích ma túy, Vol. 8, số 4, 2000 đã được tính toán.(IV) điều tra điều kiện thủy phân1. tập trung của HCl10 mL của nồng độ khác nhau của giải pháp HCl methanolic (2,25%, 5,5%, 10%, 20%, và 25%) đã được thêm vào năm ống (10 mL mỗi) của pha loãng Ginkgo biloba chiết xuất (1.5 g mẫu hòa tan trong dung dịch methanol 80% 200 mL) sepa-rately. Hỗn hợp mỗi refluxed trong một bồn tắm nước 85˚C cho30 phút, sau khi làm mát, hỗn hợp mỗi spiked với nội bộ tiêu chuẩn. Cuối cùng, khối lượng đã được đưa đến 25 mL vớigiải pháp 80% methanol và sau đó được phân tích bởi hệ HPLC. CácHệ HPLC điều kiện đã là giống như mô tả ở trên.2. thủy phân thời gian10 mL dung dịch HCl (20%) đã được bổ sung vào 4 ống pha loãng Ginkgo biloba chiết xuất (10 mL mỗi), và mỗi kết hợp-ture refluxed trong một nước tắm (85˚C) cho 15, 30, 60, và120 phút, tương ứng. Sau khi làm mát, hỗn hợp mỗi spiked với is và đưa đến 25 mL với 80% methanol soluti

Kết quả (Việt) 2:

Đánh giá về Phân tích định lượng Flavonoid aglycones trong Ginkgo biloba Extract và nó Sản phẩm LIN-CHIN, YI-RONG LIN, CHENG-YU HUANG và Kuo-CHING WEN * Phòng thí nghiệm Quốc Thực phẩm và Thuốc, Sở Y tế, hành chính, 161-2 , Kuen Yang Street, Nankang 115, Đài Bắc, Đài Loan, Trung Hoa Dân Quốc (Received: 31 Tháng 12 năm 1999; Accepted: 01 tháng 5 năm 2000) TÓM TẮT Một phương pháp HPLC đơn giản và nhanh chóng được phát triển để đánh giá và xác nhận việc khảo nghiệm quercetin, kaempferol và isorhamnetin trong chiết xuất ginkgo biloba và sản phẩm của mình. Các cột được sử dụng là Cosmosil 5C18-AR, và pha động là MeOH: 0,3% H3PO4 (1: 1). Các hệ số lation corre hiệu chuẩn tuyến tính cho quercetin, kaempferol và isorhamnetin là 0,9999, 0,9999, và 0,9989, tương ứng. Độ lệch chuẩn chính kịp thời quan hệ của những xét nghiệm trong ngày cho quercetin, kaempferol, và isorhamnetin là 0,29%, 0,28% và 1,90%, tương ứng; xét nghiệm tế ngày là 0,95%, 0,85% và 1,67%, tương ứng. Sự phục hồi của quercetin, kaempferol và isorhamnetin là 87,4%, 94,0%, và 72,4% tương ứng. Các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân axit của glycosides flavonoid trong Ginkgo biloba chiết xuất có thể đạt được bằng cách chảy ngược với 20,0% HCl ở 85C trong 15 phút hoặc với 5,5% HCl ở nhiệt độ như trong 30 phút. Từ khóa: Ginkgo biloba extract, HPLC , quercetin, kaempferol, isorhamnetin INTRODUCTIOM Ginkgo Semen là hạt giống của Ginkgo biloba L. và clas- sified trong Họ Bạch quả. Khô Ginkgo Semen được sử dụng như một loại thuốc truyền thống của Trung Quốc với một tên gọi chung "bai- guo". Các thành phần trong bai-guo bao gồm protein, chất béo, và carbohydrate. Ngoài Trung Quốc, những người phương Tây cũng đã sử dụng Ginkgo biloba lá chiết xuất làm thuốc. Flavonoid glycoside và terpene lactones (bao gồm ginkgolides và bilobalides) là hai nhóm chính của các hoạt chất trong lá Ginkgo biloba. Dựa trên các tài liệu (1-5) và đồ thị mono- báo cáo của các chuyên gia trong hoa hồng E của Viện liên bang cho thuốc và thiết bị y tế của Đức, các chức năng y học của Ginkgo biloba bao gồm (1) cải thiện khả năng chịu thiếu oxy, đặc biệt trong não mô (2) ức inhi- của sự phát triển của phù não và khả năng tăng tốc của hồi quy của nó traumatically hoặc toxically gây ra; (3) bất hoạt của các gốc oxy độc hại (flavonoids); (4) onism antag- của yếu tố tiểu cầu kích hoạt (PAF) bởi ginkgolides; (5) bảo vệ dây thần kinh bằng cách ginkgolides A và B và bilobalides. Kể từ Ginkgo biloba đã được chứng minh để cải thiện culation huống máu của các mao mạch và não, gần đây nó đã factured manu- vào nhiều sản phẩm như máy tính bảng, máy tính bảng bọc đường, phim tráng tablet, uống dung dịch, thả, và tiêm. Vì vậy, các trường hợp đăng ký Ginkgo biloba chiết xuất và các sản phẩm có nguồn gốc của nó đang gia tăng ở Đài Loan. Đến nay, chất flavonoid có trong các sản phẩm này là những thành phần chỉ được yêu cầu xét nghiệm bởi các nhà sản xuất. Việc phân tích các chất flavonoid có thể đạt được tia UV và các phương pháp HPLC. Tuy nhiên, do có quá nhiều lý do và phát hiện bảng tranh giữa hai phương pháp này, việc tính toán và titation QUÂN được thể hiện theo nhiều cách khác nhau. * Tác giả cho thư. Tel: [phone]; Fax: [phone]; E-mail: [e-mail] Các phương pháp sử dụng tia cực tím quercetin như Sở NN & PTNT các chuẩn tham chiếu. Các mẫu được thủy phân, phản ứng với AlCl3 để tạo màu, và sau đó định lượng với máy quang phổ UV. Kể từ khi các yếu tố được sử dụng để tính toán tổng flavonoids không phải là một hằng số, độ lệch của phương pháp này là luôn luôn lớn. Ngoài ra, proanthocyanidines trong các mẫu có thể gây trở ngại cho việc phát hiện và giảm sự lặp lại của các kết quả. Hơn nữa, phương pháp UV không (4) cụ thể và dần dần được thay thế bằng phương pháp HPLC. Vì lý do này và đề nghị của Phòng thí nghiệm Quốc gia Thực phẩm và Thuốc, Sở Y tế của Đài Loan đã được nêu trong Pháp lệnh 1995/11/01. (7) rằng phương pháp HPLC là một phương pháp được đề nghị kiểm tra các thành phần trong nguyên liệu của Ginkgo biloba lá trích xuất và các sản phẩm có nguồn gốc của nó. Sử dụng quercetin, kaempferol và isorhamnetin như các tiêu chuẩn tham chiếu cho phương pháp HPLC, các mẫu được thủy phân và sau đó được phân tích bằng HPLC. Mặc dù năm loại cột C18 sử dụng để phân tích flavonoid đã evalu- ated và báo cáo (5), hiện đang phát triển phương pháp này là, tuy nhiên, khác với các phương pháp báo cáo chính thức và trong mẫu trước khi điều trị, cột và pha động lựa chọn, phát hiện bước sóng , và tỷ lệ pha động chảy. Như vậy, mục tiêu của nghiên cứu này là để đánh giá lại phương pháp HPLC sử dụng để định lượng quercetin, kaempferol, và Netín isorham- trong Ginkgo biloba chiết xuất lá và các sản phẩm có nguồn gốc của nó và phát triển một tách và định lượng phương pháp tối ưu. Nghiên cứu này cũng nghiên cứu các điều kiện thủy phân của glycosides flavonoid, lựa chọn các cột HPLC và pha động, lặp lại của các phân tích, và phục hồi của mỗi hợp chất tiêu chuẩn. Phương pháp phát triển này đã được đánh giá bằng cách sử dụng các sản phẩm thương mại như Ginkgo biloba thử nghiệm pounds đồng để thiết lập một phương pháp chính thức để phân tích chất flavonoid có trong các sản phẩm này. Journal of Food and Drug Phân tích, Vol. 8, số 4, 2000 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP I. Dụng cụ HITACI HPLC được trang bị với một máy bơm L-7100 và một L- 7400 detector. II. HPLC Cột 1. Cosmosil 5C18-AR (4,6  150 mm, 5μ m) (Waters, Milford, MA, USA) 2. LiChrospher 100RP-18 (4,0  125 mm, 5 μ m) (Merck, Hohenbrunn, Đức) 3. μ -Bondapak C18 (3,9  300 mm, 10 μ m) (Waters, Milford, MA, USA) 4. Inertsil ODS-2 (4,6  250 mm, 5 μ m) (GL Khoa học, Kyoto, Nhật Bản) 5. Cosmosil 5C18-MS (4,6  150 mm, 5 μ m) (Waters, Milford, MA, USA) 6. Đối xứng (4,6  150 mm, 5 μ m) (Waters, Milford, MA, USA) 7. Nucleosil 5C18 (4,6  150 mm, 5 μ m) (Phenomenex, Torrance, CA, USA) 8. Hypersil 5C18 (4,6  150 mm, 5 μ m) (Phenomenex, Torrance, CA, USA) 9. Prodigy 5 ODS-2 (4,6  250 mm, 5 μ m) (Phenomenex, Torrance, CA, USA) III. Các hợp chất tiêu chuẩn và Hoá chất (I) Tiêu chuẩn các hợp chất quercetin, kaempferol, và isorhamnetin được pur- đuổi từ EXTRA SYNTHESE Công ty (Genay, Pháp). Morin đã từ NACALAI Công ty (Kyoto, Nhật Bản). (II) Hoá chất Na2HPO4 • 12H2O, NaH2PO4 • 2H2O, và KH2HPO4 là từ Wako Công ty (Osaka, Nhật Bản); sodium 1-octanesulfonate (PICB8) đã từ SIGMA Co. (St. Louis, MO, USA); axit phoric, phospho và acid acetic là từ Merck Công ty (Hohenbrunn, Đức). (III) Dung môi Methanol và acetonitrile được lấy từ Công ty Thí nghiệm-SCAN (Dublin, Ireland); tertrahydrofuran (THF) đã từ Merck Công ty Tất cả các dung môi là lớp HPLC. (IV) Các mẫu chiết xuất Ginkgo biloba đã được mua từ Công ty TNHH Tradshine (nhập khẩu từ Boral Quimica, SA, Tây Ban Nha). Mười hai sản phẩm thương mại có sẵn Ginkgo biloba gồm 8 mẫu viên nén bao phim và một mẫu của đường coat- ed máy tính bảng, máy tính bảng, thả, và dung dịch uống. IV. Phương pháp (I) Nghiên cứu các điều kiện HPLC 1. Lựa chọn của giai đoạn Mobile Chín giai đoạn di động khác nhau đã được đánh giá là quercetin riêng, kaempferol, và isorhamnetin, và Cosmosil 5C18- MS cột được sử dụng như là các cột HPLC. Thời gian lưu (t R), duy trì tương đối (), và độ phân giải (Rs) là kết quả của giai đoạn di động khác nhau được so sánh, và giai đoạn di động thích hợp nhất có thể được lựa chọn. 2. Lựa chọn các cột HPLC Chín cột HPLC với methanol: 0,3% H3PO4 (1: 1) là giai đoạn di động được đánh giá để phân tích quercetin, kaempferol, và isorhamnetin. Thời gian lưu (t R), asym- metry của đỉnh (As), độ phân giải (Rs), và biển số (N) thu được từ các cột khác nhau được so sánh, và các cột tốt nhất có thể được lựa chọn. (II) HPLC phân tích các sản phẩm thương mại 1. Chuẩn bị các sản phẩm thương mại cho HPLC phân tích từ bốn đến năm máy tính bảng mẫu (hoặc 5,0 ml cho mẫu lỏng) là mặt đất và 20 ml dung dịch 80% methanol được thêm vào để hòa tan mẫu. Sau khi làm rung trong 30 phút, hỗn hợp đã được đặt sang một bên cho đến khi hai giai đoạn đã được tách ra. Mười mL của các lớp trên đã được gỡ bỏ và điều trị với 10 ml dung dịch HCl 5,5%. Các giải pháp được hồi lưu trong bồn tắm nước 85C trong 30 phút. Cuối cùng các giải pháp đã được lọc và đã sẵn sàng để phân tích HPLC. 2. Điều kiện HPLC Cột, Cosmosil 5C18-AR (150 mm); điện thoại di động giai đoạn, methanol: 0,3% H3PO4 (1: 1); tỷ lệ, 1,0 ml / phút chảy; detec bước sóng tion, 370 nm. (III) Curves chuẩn của Quercetin, kaempferol, và Isorhamnetin Quercetin, kaempferol, isorhamnetin, và morin (tiêu chuẩn nal tế) được đo lường một cách chính xác và đã được hòa tan trong dung dịch riêng rẽ methanol 80%. Quercetin giải pháp đã được tiếp tục pha loãng đến 500, 110, 53, và 26 μ g / mL; giải pháp kaempferol đến 470, 100, 50, và 25 μ g / mL; isorhamnetin sự giải pháp để 270, 54, 27, và 13 μ g / mL. Chuẩn nội (44 μ g / mL) đã tăng vọt vào mỗi pha loãng, lúc đó ana lyzed bằng HPLC. Các đường cong chuẩn đã thu được bằng plot- ting các tỷ lệ diện tích cao điểm (Y-axis) của các hợp chất tiêu chuẩn để các tiêu chuẩn nội bộ so với nồng độ của chất chuẩn (X-axis). Theo những đường cong chuẩn, hồi quy tuyến tính (Y = ax + b) và hệ số tương quan Journal of Food and Drug Phân tích, Vol. 8, số 4, 2000 đã được tính toán. (IV) Điều tra các điều kiện thủy phân 1. Nồng độ HCl Ten mL nồng độ khác nhau của dung dịch HCl methanol (2.25%, 5.5%, 10%, 20%, và 25%) đã được bổ sung đến năm ống (10 mL mỗi nhóm) pha loãng chiết xuất Ginkgo biloba (1,5 g mẫu hòa tan trong 200 ml 80% methanol) sepa- rately. Mỗi hỗn hợp được đun hồi lưu trong một bồn tắm nước 85C cho 30 phút, sau khi làm mát, mỗi hỗn hợp đã tăng vọt với chuẩn nội. Cuối cùng, khối lượng đã được đưa đến 25 ml với dung dịch methanol 80% và sau đó được phân tích bằng HPLC. Các điều kiện HPLC là giống như mô tả ở trên. 2. Thời gian thủy phân Mười mL dung dịch HCl (20%) đã được bổ sung vào 4 ống pha loãng chiết xuất Ginkgo biloba (10 mL mỗi), và mỗi ture mix- được hồi lưu trong một cốc nước (85C) cho 15, 30, 60, và 120 phút, tương ứng. Sau khi làm mát, mỗi hỗn hợp đã tăng vọt với IS và mang đến 25 ml với 80% soluti methanol