Figure 3. Transplanted human induce

Figure 3. Transplanted human induced pluripotent stem cell-derived long-term self-renewing neuroepithelial-like stem (hiPS-lt-NES) cells survive and differentiate in the injured spinal cord of nonobese diabetic-severe combined immunodeficient mice.(A): Survival of transplanted cells was checked every week using a bioluminescence imaging system; left, 2 hours after transplantation; middle, 4 weeks after SCI; and right, 8 weeks after SCI.(B): Time course of transplanted hiPS-lt-NES cell survival in SCI model mice. Optical signal intensity was measured using the bioluminescence imaging system. Quantification of the photon intensity revealed that approximately 20% of the transplanted cells survived 5 weeks after SCI; thereafter, the photon signals remained stable. Data are means6SEM (n¼6).(C):Sagittal sections of SCI model mice treated with hiPS-lt-NES cells at 8 weeks after transplantation. Sections were stained with anti-GFP antibody (green). The epicenter of the SCI is indicated (*). Higher-magnification images of the white dotted boxes (C-1 and C-2) show GFP-positive transplant-derived cells extending their processes into gray and white matter.(D): Immunostaining images, 8 weeks after injury, of hiPS-lt-NES cells grafted into spinal cord. Spinal cord sections were stained with anti-GFP (green), hGFAP (magenta) and Tuj1 (red) antibodies and with Hoechst (blue). (E): Confocal images, 8 weeks after injury, of hiPS-lt-NES cells transplanted into spinal cord, revealing transplanted cells which were double-positive for GFP and markers of neural lineages.(F): Quantitative analyses of Tuj1-positive neurons, hGFAP-positive astrocytes, and MBP-positive oligodendrocytes as in E. Data are means6SD (n¼3). Scale bars¼500lm in C, 100lm in C-1, C-2, D, and E. Abbreviations: GFP, green fluorescent protein; hGFAP, anti-human-specific glial fibrillary acidic protein; MBP, and SCI, spinal cord injury.
hiPS-Lt-NES Cell Transplantation Does Not Promote CST Axon Re-Extension After SCI
Since transplanted NSCs have been reported to play a supportive role in the re-extension of injured axons [29], we examined the effect of the transplanted hiPS-lt-NES cells on CST first-order axonal regeneration. We injected BDA into the bilateral motor cortices and labeled CST first-order neuron axons by anterograde tracing [21, 22]. Because BDA is not transported from first- to second-order neurons across the synapse, only the axons of first-order neurons in the CST are visualized by this method.
In the region caudal to the injury site, >50% of the labeled fibers observed at 5 mm anterior to the lesion site were detected in the intact mice, whereas almost no BDA-traced CST fibers could be seen in the SCI control or hiPS-lt-NES cell-transplanted mice (Fig. 4A). Quantitative analysis revealed that there was no significant difference in the number of BDA-labeled fibers between the SCI control and hiPS-lt-NES cell-treated groups at any position up to 5 mm on either side of the lesion site (Fig. 4B). Although we cannot exclude possibilities such as the re-extension of descending raphespinal axons, which are also important for the motor functional recovery of hind limbs [30, 31], these results suggest that the regeneration of CST axons, if it occurs, cannot be a major contributing factor in the recovery induced by hiPS-lt-NES cell transplantation in our SCI model.
Local Neurons Reconstruct Disrupted CST Neuronal Circuits in a Relay Manner
Recent studies have revealed that local endogenous and transplant-derived neurons can form new neuronal circuits and make synaptic connections after SCI [32–34]. To determine whether disrupted CSTs were reconstructed by forming a local neuronal relay, we injected WGA-expressing adenoviruses into the motor cortex of the hind limb area at 12 weeks after SCI. WGA, a plant lectin, has been widely used as a tracer of neuronal pathways [24, 25] because it is transported in axons and dendrites, and across synapses, to second- and even third-order neurons.
After injection, we could detect WGA-immunoreactive in-tracellular granule-like structures in MAP2ab-positive neurons (Fig. 5A). Furthermore, we found that hiPS-lt-NES cell-treated mice had more WGA/Map2ab double-positive cells than SCI control mice in the caudal region below the injured site (Fig. 5A, 5B). Taking these data and the results of the BDA experiment into consideration, it is suggested that WGA was transferred to the caudal area through the lesion site vianew synaptic connections, and that hiPS-lt-NES cell transplantation promoted the CST reconstruction without CST axonal re-extension. In support of this proposition, we could observe GFP-positive transplant-derived neurons adjacent to synaptophysin-positive patches (Fig. 5C-1 and 5C-1’). Furthermore, immunohistochemistry using species-specific antibodies for presynaptic markers revealed that transplant-derived neurons made synapses with endogenous neurons, suggesting that they reconstructed disrupted CST neuronal circuits in a relay fashion (Fig. 5C-2, 5C-2’, 5C-3, and 5C-3’).
Figure 4. hiPS-lt-NES cell transplantation does not promote corticospinal tract (CST) axon re-extension after SCI.(A): Representative pictures of BDA-labeled CST fibers (red) at 5 and 2 mm rostral and 2 mm caudal to the lesion site at 12 weeks after SCI. Hoechst (blue) shows nuclear staining. Scale bar¼50lm.(B): Quantification of the labeled CST fibers in the spinal cords of untreated, SCI control, and hiPS-lt-NES cell-transplanted mice. Thex-axis indicates specific locations along the rostro-caudal axis of the spinal cord, and the y-axis indicates the ratio of the mean number of BDA-labeled fibers at the indicated site to that at 5 mm rostral to the lesion site (thoracic vertebra [Th] 9). Intact mice were compared with SCI control mice. *,p

Kết quả (Việt) 1:

Hình 3. Transplanted của con người gây ra pluripotent tế bào gốc-có nguồn gốc dài hạn tự đổi mới giống như neuroepithelial (hông-lt-NES) tế bào gốc tồn tại và phân biệt trong tủy bị thương của nonobese bệnh tiểu đường nghiêm trọng kết hợp immunodeficient những con chuột.(A): sự sống còn của cấy ghép tế bào đã được kiểm tra mỗi tuần bằng cách sử dụng một phát quang sinh học hệ thống; hình ảnh trái, 2 giờ sau khi transplantation; Trung, tuần 4 sau khi khoa học; và đúng, 8 tuần sau khi SCI.(B): thời gian khóa học của cấy ghép hông-lt-NES di động tồn tại ở SCI mô hình chuột. Cường độ tín hiệu quang học đã được đo bằng cách sử dụng phát quang sinh học hệ thống hình ảnh. Định lượng của photon cường tiết lộ rằng khoảng 20% các cấy ghép tế bào sống sót 5 tuần sau khi khoa học; sau đó, các tín hiệu photon vẫn ổn định. Dữ liệu là means6SEM (n¼6).(C): dọc phần của SCI mẫu chuột đối xử với các tế bào hông-lt-NES lúc 8 tuần sau khi transplantation. Phần đã được nhuộm màu với kháng thể anti-GFP (màu xanh lá cây). Tâm chấn của khoa học viễn tưởng là chỉ định (*). Phóng đại cao hình ảnh của các hộp chấm trắng (C-1 và C-2) Hiển thị dương tính GFP có nguồn gốc ghép tế bào mở rộng quy trình của họ vào vấn đề màu xám và trắng.(D): Immunostaining hình ảnh, 8 tuần sau khi chấn thương, các tế bào hông-lt-NES ghép vào tủy. Tủy phần đã được nhuộm màu với anti-GFP (màu xanh lá cây), hGFAP (đỏ tươi), kháng thể Tuj1 (màu đỏ) và Hoechst (màu xanh). (E): hình ảnh Confocal, 8 tuần sau khi chấn thương, các tế bào hông-lt-NES transplanted vào tủy sống, tiết lộ cấy ghép tế bào được đôi-tích cực cho GFP và các dấu hiệu của dòng dõi thần kinh.(F): phân tích định lượng của các tế bào thần kinh Tuj1-tích cực, tích cực hGFAP astrocytes và dương tính MBP oligodendrocytes như trong E. dữ liệu là means6SD (n¼3). Quy mô bars¼500lm c, 100lm trong C-1, C-2, D và E. chữ viết tắt: GFP, màu xanh lá cây huỳnh quang protein; hGFAP, cụ thể chống human glial axít fibrillary protein; MBP, và khoa học viễn tưởng, chấn thương dây cột sống.cấy ghép tế bào hông-Lt-NES không thúc đẩy CST Axon Re-mở rộng sau khi khoa học viễn tưởngKể từ khi cấy ghép NSCs đã được báo cáo để đóng một vai trò hỗ trợ trong tái mở rộng sợi trục thần kinh bị thương [29], chúng tôi kiểm tra tác động của các tế bào hông-lt-NES cấy ghép CST đặt hàng đầu tiên tái sinh axonal. Chúng tôi tiêm BDA vào ngữ motor song phương và dán nhãn CST sợi trục thần kinh tế bào thần kinh thứ tự đầu tiên bởi anterograde truy tìm [21, 22]. Bởi vì BDA sửa vận chuyển không phải trên khớp thần kinh, từ tế bào thần kinh đầu tiên để thứ hai đặt hàng, chỉ các sợi trục thần kinh tế bào thần kinh thứ tự đầu tiên trong CST được hình dung bởi phương pháp này.Đuôi để trang web thương tích, vùng > 50% của các sợi có nhãn quan sát tại 5 mm trước để trang web của tổn thương đã được phát hiện ở những con chuột còn nguyên vẹn, trong khi hầu như không có nguồn gốc từ BDA CST sợi có thể được nhìn thấy trong khoa học viễn tưởng kiểm soát hoặc hông-lt-NES cấy ghép tế bào chuột (hình 4A). Phân tích định lượng tiết lộ rằng có là không có khác biệt đáng kể trong số lượng các sợi có nhãn BDA giữa khoa học điều khiển và hông-lt-NES xử lý di động nhóm ở vị trí bất kỳ tối đa 5 mm ở hai bên của các trang web tổn thương (hình 4B). Mặc dù chúng tôi không thể loại trừ khả năng như re-mở rộng giảm dần sợi trục thần kinh raphespinal, đó cũng là quan trọng cho việc phục hồi chức năng động cơ tay chân hind [30, 31], kết quả các đề nghị tái tạo các sợi trục thần kinh CST, nếu nó xảy ra, không thể là một yếu tố góp phần chính trong việc thu hồi gây ra bởi cấy ghép tế bào hông-lt-NES trong mô hình khoa học viễn tưởng của chúng tôi.Local Neurons Reconstruct Disrupted CST Neuronal Circuits in a Relay MannerRecent studies have revealed that local endogenous and transplant-derived neurons can form new neuronal circuits and make synaptic connections after SCI [32–34]. To determine whether disrupted CSTs were reconstructed by forming a local neuronal relay, we injected WGA-expressing adenoviruses into the motor cortex of the hind limb area at 12 weeks after SCI. WGA, a plant lectin, has been widely used as a tracer of neuronal pathways [24, 25] because it is transported in axons and dendrites, and across synapses, to second- and even third-order neurons.After injection, we could detect WGA-immunoreactive in-tracellular granule-like structures in MAP2ab-positive neurons (Fig. 5A). Furthermore, we found that hiPS-lt-NES cell-treated mice had more WGA/Map2ab double-positive cells than SCI control mice in the caudal region below the injured site (Fig. 5A, 5B). Taking these data and the results of the BDA experiment into consideration, it is suggested that WGA was transferred to the caudal area through the lesion site vianew synaptic connections, and that hiPS-lt-NES cell transplantation promoted the CST reconstruction without CST axonal re-extension. In support of this proposition, we could observe GFP-positive transplant-derived neurons adjacent to synaptophysin-positive patches (Fig. 5C-1 and 5C-1’). Furthermore, immunohistochemistry using species-specific antibodies for presynaptic markers revealed that transplant-derived neurons made synapses with endogenous neurons, suggesting that they reconstructed disrupted CST neuronal circuits in a relay fashion (Fig. 5C-2, 5C-2’, 5C-3, and 5C-3’).Figure 4. hiPS-lt-NES cell transplantation does not promote corticospinal tract (CST) axon re-extension after SCI.(A): Representative pictures of BDA-labeled CST fibers (red) at 5 and 2 mm rostral and 2 mm caudal to the lesion site at 12 weeks after SCI. Hoechst (blue) shows nuclear staining. Scale bar¼50lm.(B): Quantification of the labeled CST fibers in the spinal cords of untreated, SCI control, and hiPS-lt-NES cell-transplanted mice. Thex-axis indicates specific locations along the rostro-caudal axis of the spinal cord, and the y-axis indicates the ratio of the mean number of BDA-labeled fibers at the indicated site to that at 5 mm rostral to the lesion site (thoracic vertebra [Th] 9). Intact mice were compared with SCI control mice. *,p <.05; **, p<.01. There was no significant difference in the number of BDA-labeled fibers between hiPS-lt-NES cell-treated (blue line) and SCI control groups (red line). Data are means6SEM (n¼5). Abbreviations: BDA, biotinylated dextran amine; hiPS-lt-NES, human induced pluripotent stem cell-derived long-term self-renewing neuroepithelial-like stem; and SCI, spinal cord injury

Kết quả (Việt) 2:

Hình 3. cấy nhân induced pluripotent stem dài hạn tự đổi mới neuroepithelial giống như tế bào gốc có nguồn gốc từ tế bào (HIPS-lt-NES) tồn tại và phân biệt trong tủy sống bị thương của chuột miễn dịch kết hợp tiểu đường nặng nonobese (A).: Sự sống còn của tế bào được cấy ghép đã được kiểm tra mỗi tuần sử dụng một hệ thống hình ảnh phát quang sinh học; trái, 2 giờ sau khi ghép; giữa, 4 tuần sau khi SCI; và phải, 8 tuần sau khi SCI (B):. Tất nhiên Thời gian cấy hông-lt-NES tế bào sống ở chuột mô hình SCI. Cường độ tín hiệu quang được đo bằng cách sử dụng hệ thống hình ảnh phát quang sinh học. Định lượng cường độ photon tiết lộ rằng khoảng 20% các tế bào được cấy sống sót 5 tuần sau khi SCI; sau đó, các tín hiệu photon vẫn ổn định. Dữ liệu là means6SEM (n¼6) (C):. Phần cắt dọc của SCI chuột mô hình điều trị bằng tế bào hông-lt-NES lúc 8 tuần sau khi cấy ghép. Phần đã được nhuộm với kháng thể anti-GFP (green). Tâm chấn của SCI được chỉ định (*). Hình ảnh cao hơn, độ phóng đại của các hộp chấm trắng (C-1 và C-2) cho thấy các tế bào cấy ghép có nguồn gốc từ GFP-tích cực mở rộng quy trình của họ vào chất xám và màu trắng (D):. Hình ảnh nhuộm miễn dịch, 8 tuần sau khi chấn thương, trong hiPS- tế bào lt-NES ghép vào tủy sống. Phần tủy sống đã được nhuộm màu với anti-GFP (green), hGFAP (magenta) và kháng thể (màu đỏ) và Tuj1 với Hoechst (màu xanh). (E): hình ảnh hiển vi, 8 tuần sau khi chấn thương, các tế bào hông-lt-NES cấy vào tủy sống, tiết lộ các tế bào được cấy ghép mà là hai tích cực cho GFP và dấu ấn của dòng dõi thần kinh (F):. Những phân tích định lượng của Tuj1 dương tế bào thần kinh, tế bào hình sao hGFAP dương, và ít nhánh MBP dương như trong E. dữ liệu là means6SD (n¼3). Scale bars¼500lm trong C, 100lm ở C-1, C-2, D, và E. Các chữ viết tắt: GFP, protein huỳnh quang màu xanh lá cây; hGFAP, fibrillary thần kinh đệm protein axit chống con người cụ thể; MBP, và SCI, chấn thương tủy sống.
HIPS-Lt-NES Transplantation di động của Không Thúc đẩy CST Axon Re-Extension Sau SCI
Từ NSCs cấy ghép đã được báo cáo để đóng một vai trò hỗ trợ trong việc tái mở rộng của sợi trục thần kinh bị thương [29], chúng tôi kiểm tra ảnh hưởng của các tế bào hông-lt-NES cấy trên CST bậc tái sinh sợi trục. Chúng tôi tiêm BDA vào vỏ não vận động song phương và nhãn sợi trục CST thứ tự đầu tiên của tế bào thần kinh anterograde truy tìm [21, 22]. Bởi vì BDA là không được vận chuyển từ thứ nhất đến thứ hai tế bào thần kinh để qua khớp thần kinh, chỉ có các sợi trục của tế bào thần kinh bậc nhất trong CST được hình dung bằng phương pháp này.
Trong khu vực đuôi để trang web thương tích,> 50% của các loại sợi có nhãn quan sát ở 5 mm trước đến site tổn thương đã được phát hiện ở những con chuột còn nguyên vẹn, trong khi hầu như không có sợi CST BDA-truy có thể được nhìn thấy trong sự kiểm soát SCI hoặc hông-lt-NES chuột di cấy (Hình. 4A). Phân tích định lượng cho thấy rằng không có sự khác biệt đáng kể về số lượng các sợi BDA-dán nhãn kiểm soát giữa các SCI và hông-lt-NES nhóm tế bào được điều trị tại vị trí bất kỳ lên đến 5 mm ở hai bên của các trang web thương tổn (Fig. 4B) . Mặc dù chúng ta không thể loại trừ khả năng như tái gia hạn giảm dần sợi trục raphespinal, đó cũng là quan trọng đối với sự phục hồi chức năng vận động của chân sau [30, 31], những kết quả này gợi ý rằng sự tái sinh của CST sợi trục thần kinh, nếu nó xảy ra, có thể không được một yếu tố góp phần quan trọng trong việc thu hồi gây ra bởi hông-lt-NES cấy ghép tế bào trong mô hình của chúng tôi SCI.
Tế bào thần kinh tái tạo lại bị gián đoạn mạch CST thần kinh cục bộ trong một cách thức tiến tiếp sức
nghiên cứu gần đây đã tiết lộ rằng nội sinh địa phương và tế bào thần kinh có nguồn gốc từ ghép có thể hình thành các mạch thần kinh mới và làm cho các kết nối tiếp sau SCI [32-34]. Để xác định xem CST gián đoạn đã được xây dựng lại bằng cách hình thành một relay tế bào thần kinh ở địa phương, chúng tôi tiêm WGA-hiện adenovirus vào vỏ não vận động của các khu vực chân sau 12 tuần sau khi SCI. WGA, một lectin nhà máy, đã được sử dụng rộng rãi như một tracer của các đường thần kinh [24, 25] bởi vì nó được vận chuyển trong các sợi trục và đuôi gai và trên các khớp thần kinh, để hai và thậm chí tế bào thần kinh-thứ ba.
Sau khi tiêm, chúng ta có thể phát hiện WGA-immunoreactive trong tracellular cấu trúc hạt giống trong tế bào thần kinh MAP2ab dương (Hình. 5A). Hơn nữa, chúng tôi thấy rằng hông-lt-NES chuột tế bào được điều trị có nhiều tế bào đôi dương WGA / Map2ab hơn nhóm chuột đối chứng SCI ở vùng đuôi bên dưới trang web thương (Hình. 5A, 5B). Lấy những dữ liệu và các kết quả của các thí nghiệm BDA vào xem xét, đề nghị rằng WGA được chuyển đến khu vực đuôi thông qua các trang web thương tổn vianew kết nối tiếp hợp, và rằng hông-lt-NES cấy ghép tế bào thúc đẩy sự tái tạo mà không CST CST lại sợi trục mở rộng. Để hỗ trợ cho luận điểm này, chúng ta có thể quan sát tế bào thần kinh cấy ghép có nguồn gốc từ GFP dương liền kề với các bản vá lỗi synaptophysin dương (Hình. 5C-1 và 5C-1 '). Hơn nữa, mô miễn dịch sử dụng các loài cụ thể kháng thể cho các dấu hiệu màng trước tiết lộ rằng tế bào thần kinh cấy ghép có nguồn gốc từ thực hiện các khớp thần kinh với tế bào thần kinh nội sinh, cho thấy rằng họ tái tạo gián đoạn CST mạch thần kinh trong một thời trang relay (Fig. 5C-2, 5C-2 ', 5C-3 , và 5C-3 ').
Hình 4. hông-lt-NES cấy ghép tế bào không phát huy được ống vỏ (CST) axon tái gia hạn sau khi SCI (A):. hình ảnh đại diện của xơ CST BDA-dán nhãn (màu đỏ) tại 5 và 2 mm giống mỏ chim và 2 mm đuôi để các trang web thương tổn ở 12 tuần sau khi SCI. Hoechst (màu xanh) cho thấy nhuộm hạt nhân. Scale bar¼50lm (B):. Định lượng các sợi CST nhãn ở các dây cột sống không điều trị, SCI kiểm soát, và những con chuột được cấy tế bào-hông-lt-NES. Thex trục chỉ ra địa điểm cụ thể dọc theo trục rostro-đuôi của tủy sống, và trục y chỉ ra hệ số của số trung bình của các sợi BDA-dán nhãn tại các trang web chỉ định với ở 5 mm giống mỏ chim với trang web thương tổn (ngực đốt sống [Th] 9). Chuột còn nguyên vẹn được so sánh với nhóm chuột đối chứng SCI. *, P <0,05; **, P <0,01. Không có sự khác biệt đáng kể về số lượng các sợi BDA-nhãn giữa các tế bào được điều trị (đường màu xanh) hông-lt-NES và nhóm kiểm soát SCI (đường màu đỏ). Dữ liệu là means6SEM (n¼5). Chữ viết tắt: BDA, biotinylated amin dextran; HIPS-lt-NES, người induced pluripotent stem cell có nguồn gốc lâu dài tự đổi mới gốc neuroepithelial giống; và SCI, chấn thương tủy sống