We have previously detailed our cli

We have previously detailed our clinical results employing a monocyte-derived, LPS-activated, HER-2/neu-expressing dendrit- ic cell immunotherapeutic agent against HER-2/neu-positive ductal carcinoma in situ [13]. Prior studies have demonstrated that signals through a variety of Toll-like receptors including TLR-4 are capable of inhibiting regulatory T cells. Thus, we here hypothesized that our dendritic cell vaccine engenders a potent immune response in part by deactivating regulatory T cells. We first demonstrated that CD4+CD25+ T cells inhibit effector T cell proliferation in the presence of immature dendritic cells. We then illustrated a break in Treg-mediated suppression in the presence of the DC1 vaccine, as CFSE-positive effectors exhibit robust proliferation despite the presence of the regulatory complement. This effect occurred across a semi-permeable membrane and thus was cell contact-independent. The use of CFSE and more specifically the labeling of effector cells alone is a central aspect of this experimental model. Proliferation assays used to demonstrate suppression in many other studies suffer from their reliance on tritiated thymidine. Numerous reports demonstrate that regulatory T cells are not completely anergic and in fact have significant proliferative potential especially in the context of inflammatory signals [23,24]. Assays based on tritiated thymidine cannot account for regulatory cell proliferation making the data difficult to interpret. Our CFSE-based assay tracks proliferation specifically amongst effector cells and directly compares their proliferation in the presence/absence of Tregs and varying dendritic cell populations. In doing so, it eliminates the possibility that proliferation by CD4+CD25+ regulators promotes misinter- pretation of results. A number of recent studies have demonstrated that a variety of Toll-like receptors including TLR-2, TLR-4, TLR-8, and TLR-9 can abrogate Treg-mediated suppression [6-11]. Perhaps of most relevance to our own study is that of Pasare and Medzhitov [9]. These authors demonstrated that dendritic cells activated with LPS secrete soluble factor(s) that release effector cells from suppression by CD4+CD25+ T cells. IL-6 was required for this effect but appeared to act synergistically with one or more other cytokines. Our results are largely compatible with these findings but extend them in a number of respects. First, our study was conducted using human cell populations including a dendritic cell currently in use in immunotherapy. This translates the prior findings directly to the clinical venue. Secondly, while these authors added LPS directly to dendritic cells to induce their effect, our study shows that dendritic cells activated with LPS then transferred to co-cultures containing Tregs and effectors remain capable of breaking suppression. This finding indicates an enduring effect on the APC and suggests prolonged secretion of a soluble mediator(s) capable of inhibiting regulators. Further, the suggestion that LPS breaks Treg-mediated suppression by acting on the suppressor population or effectors directly is excluded here. Rather, it is the LPS-activated dendritic cell that mediates the effects. Third, our study demonstrates an effect which is IL-6 and IL-12-independent but appears mediated by a soluble factor. It is plausible that this factor synergizes with IL-6 in the aforemen- tioned study. Lastly, our data indicate that the Treg population here is not only temporarily deactivated, but may also contribute to developing immunity through conversion into T-bet-positive, IFN-c-secreting effectors. The latter finding in concert with those of other groups suggests a new paradigm for the integration of regulatory T cells into the immune milieu. Tregs are currently viewed as principal mediators of peripheral tolerance that control inflammatory immune responses and prevent autoimmunity. How a productive immune response is initiated despite the presence and activity of these cells is not entirely certain. Studies demonstrating Treg inhibition in the context of inflammation suggests one model—that inflammatory signals encountered in the setting of pathogenic insult deactivate regulators to initiate immunity. Of note in this regard is our finding that a TLR-activated dendritic cell restores proliferation of responder cells despite the presence of Tregs. Recent studies illustrating conversion of Tregs into antigen-specific Th17 cells extend this model by suggesting that Tregs may play an active role in the immune response rather than simply bystanding [19–22]. Our data support this postulate as well. However, in our model, the Toll-activated dendritic cell predominantly secretes IFN-c and thus better reflects a Th1 cell. Interestingly, this finding unlike the effect noted on the proliferative response was IL-12-dependent. Collectively, these data raise several possibilities regarding the function of regulatory T cells in the developing immune response. First is that distinct signals direct cessation of Treg activity versus conversion into cytokine-producing effectors. It is plausible that signals present during the initiation of the immune response determine its magnitude in part by deciding whether Tregs bystand passively or contribute as cytokine-producing effectors. Second is that Tregs may be converted into various subsets of antigen-specific effectors (Th1, Th2, Th17) depending on the type of immune response mandated. On a molecular basis, this may occur through the upregulation of lineage-specific transcription factors (e.g. T- bet), and cells may at least transiently express high levels of factors that direct both the regulatory and the effector phenotype. These cells would then act synergistically with similarly differentiated, liberated FoxP3-negative cells to maximize immunity. That IFN- c-secreting Tregs may still remain in a regulatory role dampening Th1 responses through direct contact and/or inhibitory cytokines has also been observed [25,26]; this could still occur while proliferative responses are nonetheless licensed. Regardless, how Treg function is restored to temper the immune response upon pathogen eradication remains a mystery. Previous studies have shown that Tregs activated to produce IL-17 may retain suppressive capacity if removed from the inflammatory environ- ment [21]. Our results also carry import regarding the design of tumor immunotherapy vaccines. Regulatory T cells have proven problematic in attempts to induce tumor immunity since the 1980s [27]. Given the potential significance of Tregs in immuno- therapy, several recent protocols combine anti-tumor vaccines with agents that deplete Tregs. These combined approaches often exhibit greater benefit than either agent alone [28–34]. Thus, maximizing vaccine efficacy may require subversion of regulatory processes. Notably, several recent studies have shown that a variety of vaccination strategies increase the frequency and/or potency of regulatory T cells [35–37]. Perhaps most notably, dendritic cells matured using a conventional cytokine cocktail were found to expand FoxP3high cells that appear to have suppressor function [38]. This may compromise the development and endurance of tumor immunity. By contrast, the DC1 dendritic cell vaccine is ideal in that it appears to inhibit rather than activate T cell-mediated suppression and may carry the added benefit of converting these cells into tumor-reactive effectors. In our model, Treg inhibition in the presence of the DC1 vaccine was not observed in the presence of dendritic cells matured using a conventional protocol. Although there has been no direct comparison of the DC1 vaccine to dendritic cells matured using conventional protocols, the effects on Treg function demonstrated here may render it more effective and may account in part for the findings noted in the clinical venue.

Kết quả (Việt) 1:

Chúng tôi đã có chi tiết kết quả lâm sàng của chúng tôi sử dụng một nguồn gốc monocyte, LPS kích hoạt, HER-2/neu-thể hiện dendrit-ic di động immunotherapeutic đại lý chống lại ung thư ductal HER-2/neu-tích cực tại chỗ [13]. Trước nghiên cứu đã chứng minh rằng các tín hiệu thông qua một loạt các thụ thể giống như số điện thoại bao gồm TLR-4 có khả năng ức chế tế bào T quy định. Do đó, chúng tôi ở đây đưa ra giả thuyết rằng chúng tôi vắc xin tế bào cây trong khoáng vật sanh ra một phản ứng miễn dịch mạnh một phần bởi tắt quy định các tế bào T. Chúng tôi lần đầu tiên chứng minh rằng tế bào CD4 CD25 T ức chế effector tế bào T gia tăng sự hiện diện của chưa trưởng thành tế bào cây trong khoáng vật. Sau đó chúng tôi minh họa một break trong Treg trung gian ức chế sự hiện diện của thuốc chủng DC1, như là tích cực CFSE phồng triển lãm sự gia tăng mạnh mẽ bất chấp sự hiện diện của quy định bổ sung. Hiệu ứng này xảy ra trên một màng bán thấm và do đó là di động độc lập liên lạc. Việc sử dụng của CFSE và cụ thể hơn các nhãn của tế bào effector một mình là một khía cạnh Trung tâm của mô hình thử nghiệm này. Phổ biến vũ khí thử nghiệm được sử dụng để chứng minh các đàn áp trong nhiều nghiên cứu khác bị của sự phụ thuộc vào siêu nặng thymidine. Nhiều báo cáo chứng minh rằng tế bào T quy định này không hoàn toàn anergic và trong thực tế có tiềm năng đáng kể proliferative đặc biệt là trong bối cảnh của viêm tín hiệu [23,24]. Thử nghiệm dựa trên siêu nặng thymidine không thể tài khoản cho quy định di động phổ biến làm cho dữ liệu khó khăn để giải thích. Chúng tôi dựa trên CFSE khảo nghiệm theo dõi phổ biến vũ khí đặc biệt giữa các tế bào effector và trực tiếp so sánh của họ gia tăng trong sự hiện diện/sự vắng mặt của Tregs và quần thể tế bào cây trong khoáng vật khác nhau. Bằng cách đó, nó giúp loại bỏ khả năng rằng sự gia tăng do điều chỉnh CD4 CD25 khuyến khích misinter-pretation của kết quả. Một số nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng một loạt các thụ thể giống như số điện thoại bao gồm TLR-2, TLR-4, TLR-8, và TLR-9 có thể thay bỏ qua trung gian Treg đàn áp [6-11]. Có lẽ hầu hết liên quan đến nghiên cứu riêng của chúng tôi là Pasare và Medzhitov [9]. Các tác giả đã chứng minh rằng tế bào cây trong khoáng vật kích hoạt với LPS tiết hòa tan factor(s) phát hành các tế bào effector từ đàn áp bởi các tế bào CD4 CD25 T. IL-6 đã được yêu cầu cho hiệu ứng này nhưng xuất hiện hành động synergistically với một hoặc nhiều khác phân bào. Kết quả của chúng tôi phần lớn tương thích với những phát hiện này nhưng mở rộng chúng trong một số khía cạnh. Đầu tiên, nghiên cứu của chúng tôi được thực hiện bằng cách sử dụng quần thể tế bào của con người bao gồm một tế bào cây trong khoáng vật hiện đang sử dụng trong immunotherapy. Những phát hiện trước trực tiếp đến địa điểm lâm sàng điều này. Thứ hai, trong khi những bổ sung tác giả LPS trực tiếp đến các tế bào cây trong khoáng vật để tạo ra hiệu quả của họ, chúng tôi nghiên cứu cho thấy rằng tế bào cây trong khoáng vật kích hoạt với LPS sau đó chuyển sang đồng nền văn hóa có chứa Tregs và phồng vẫn có khả năng phá vỡ đàn áp. Tìm kiếm này cho thấy ảnh hưởng lâu dài trên APC và đề nghị kéo dài bài tiết của một mediator(s) hòa tan có khả năng ức chế điều chỉnh. Hơn nữa, gợi ý rằng LPS phá vỡ qua trung gian Treg đàn áp bởi tác động lên các ống hãm thanh dân hoặc phồng trực tiếp loại trừ ở đây. Thay vào đó, nó là sự kích hoạt LPS cây trong khoáng vật tế bào hàm các hiệu ứng. Thứ ba, chúng tôi nghiên cứu chứng tỏ một hiệu ứng mà là IL-6 và 12-IL độc lập nhưng xuất hiện trung gian bởi một nhân tố hòa tan. Nó là chính đáng rằng yếu tố này synergizes với IL-6 trong nghiên cứu aforemen-tioned. Cuối cùng, dữ liệu của chúng tôi cho thấy rằng dân Treg ở đây không chỉ tạm thời ngừng hoạt động, nhưng cũng có thể đóng góp để phát triển khả năng miễn dịch thông qua chuyển đổi vào đặt cược-T dương tính, IFN-c-tiết phồng. Việc tìm kiếm thứ hai trong buổi hòa nhạc với những người khác cho thấy một mô hình mới cho hội nhập của các tế bào T quy định vào bồng bột miễn dịch. Tregs hiện đang được xem như là hòa giải chính ngoại vi khoan dung mà kiểm soát viêm phản ứng miễn dịch và ngăn chặn autoimmunity. Làm thế nào một phản ứng miễn dịch sản xuất được khởi xướng bất chấp sự hiện diện và hoạt động của các tế bào là không hoàn toàn nhất định. Nghiên cứu chứng minh sự ức chế Treg trong bối cảnh của viêm cho thấy một mô hình-viêm tín hiệu gặp phải trong các thiết lập của xúc phạm gây bệnh tắt điều chỉnh để bắt đầu khả năng miễn dịch. Đáng chú ý trong lĩnh vực này là chúng tôi tìm kiếm một tế bào cây trong khoáng vật TLR kích hoạt khôi phục sự gia tăng của các tế bào responder bất chấp sự hiện diện của Tregs. Nghiên cứu gần đây minh hoạ chuyển đổi Tregs vào các kháng nguyên cụ thể Th17 tế bào mở rộng mô hình này bằng cách gợi ý rằng Tregs có thể đóng một vai trò tích cực trong phản ứng miễn dịch chứ không phải là các chỉ đơn giản là bystanding [19-22]. Dữ liệu của chúng tôi hỗ trợ tiên đề này là tốt. Tuy nhiên, trong mô hình của chúng tôi, số điện thoại kích hoạt tế bào cây trong khoáng vật chủ yếu là tiết ra IFN-c và do đó tốt hơn phản ánh một tế bào Th1. Điều thú vị, việc tìm kiếm này không giống như có hiệu lực lưu ý trên các phản ứng proliferative là IL-12-phụ thuộc. Nói chung, các dữ liệu nâng cao một số khả năng liên quan đến các chức năng của tế bào T quy định trong các phản ứng miễn dịch đang phát triển. Đầu tiên là khác biệt tín hiệu trực tiếp sự chấm dứt của Treg hoạt động so với chuyển đổi thành sản xuất cytokine phồng. Nó là chính đáng rằng tín hiệu hiện nay trong việc khởi xướng của các phản ứng miễn dịch xác định cường độ của nó một phần bởi quyết định cho dù Tregs bystand thụ động hoặc đóng góp như sản xuất cytokine phồng. Thứ hai là Tregs có thể được chuyển đổi thành các tập con khác nhau của kháng nguyên cụ thể phồng (Th1, Th2, Th17) tùy thuộc vào loại phản ứng miễn dịch uỷ thác. Trên cơ sở phân tử, điều này có thể xảy ra thông qua upregulation yếu tố phiên mã dòng dõi cụ thể (ví dụ như là T-bet), và tế bào có thể ít mặt nhận mức độ cao của các yếu tố trực tiếp cả các quy định và các kiểu hình effector. Các tế bào sẽ sau đó hành động synergistically với tương tự như vậy phân biệt, giải phóng âm FoxP3 tế bào để tối đa hóa khả năng miễn dịch. Đó Tregs IFN-c-tiết có thể vẫn còn trong một vai trò quản lý làm giảm Th1 phản ứng thông qua tiếp xúc trực tiếp và/hoặc ức chế phân bào cũng đã được quan sát thấy [25,26]; Điều này vẫn có thể xảy ra trong khi proliferative phản ứng Tuy nhiên được cấp phép. Bất kể, làm thế nào Treg chức năng được phục hồi để bình tĩnh phản ứng miễn dịch khi tiêu diệt mầm bệnh vẫn là một bí ẩn. Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng Tregs kích hoạt để sản xuất IL-17 có thể giữ lại khả năng h: nếu loại bỏ từ viêm environ-ment [21]. Kết quả của chúng tôi cũng thực hiện chuyển nhập liên quan đến thiết kế của khối u immunotherapy vắc xin. Quy định các tế bào T đã được chứng minh có vấn đề trong các nỗ lực để tạo ra các khối u miễn dịch kể từ những năm 1980 [27]. Đưa ra ý nghĩa tiềm năng của Tregs trong miễn dịch-điều trị, giao thức tại một số kết hợp các vắc xin chống khối u với các đại lý triệt binh Tregs. Các phương pháp tiếp cận kết hợp thường thể hiện lợi ích lớn hơn hoặc đại lý một mình [28-34]. Do đó, tối đa hóa hiệu quả của vắc xin có thể yêu cầu subversion của quy định quy trình. Đáng chú ý, một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng một số chiến lược tiêm phòng tăng tần suất và/hoặc tiềm năng của quy định T tế bào [35-37]. Có lẽ đáng chú ý nhất, các tế bào đuôi gai trưởng thành bằng cách sử dụng một loại cocktail cytokine thông thường được tìm thấy để mở rộng các tế bào FoxP3high dường như có ức chế chức năng [38]. Điều này có thể thỏa hiệp sự phát triển và độ bền của khối u miễn dịch. Ngược lại, vắc xin tế bào đuôi gai DC1 là lý tưởng, trong đó nó xuất hiện để ức chế chứ không phải là kích hoạt qua trung gian tế bào T đàn áp và có thể thực hiện lợi ích bổ sung để chuyển đổi các tế bào thành khối u phản ứng phồng. Trong mô hình của chúng tôi, Treg ức chế sự hiện diện của thuốc chủng DC1 được không quan sát thấy sự hiện diện của tế bào đuôi gai trưởng thành bằng cách sử dụng một giao thức thông thường. Mặc dù đã có không có so sánh trực tiếp vắc-xin DC1 để tế bào cây trong khoáng vật trưởng thành bằng cách sử dụng giao thức thông thường, các hiệu ứng ngày chức năng Treg đã chứng minh ở đây có thể làm cho nó hiệu quả hơn và có thể chiếm một phần kết quả ghi nhận tại địa điểm lâm sàng.