Chapter 4: Electrophoresis - Introd

Chapter 4: Electrophoresis - Introduction


Figure 4.1 Hoefer SE 400 Sturdier Electrophoresis units

Electrophoresis may be the main technique for molecular separation in today's cell biology laboratory. Because it is such a powerful technique, and yet reasonably easy and inexpensive, it has become commonplace. In spite of the many physical arrangments for the apparatus, and regardless of the medium through which molecules are allowed to migrate, all electrophoretic separations depend upon the charge distribution of the molecules being separated. 1

Electrophoresis can be one dimensional (i.e. one plane of separation) or two dimensional. One dimensional electrophoresis is used for most routine protein and nucleic acid separations. Two dimensional separation of proteins is used for finger printing , and when properly constructed can be extremely accurate in resolving all of the proteins present within a cell (greater than 1,500).

The support medium for electrophoresis can be formed into a gel within a tube or it can be layered into flat sheets. The tubes are used for easy one dimensional separations (nearly anyone can make their own apparatus from inexpensive materials found in any lab), while the sheets have a larger surface area and are better for two- dimensional separations. Figure 4.1 shows a typical slab electrophoresis unit.

When the detergent SDS (sodium dodecyl sulfate) 2 is used with proteins, all of the proteins become negatively charged by their attachment to the SDS anions. When separated on a polyacrylamide gel, the procedure is abbreviated as SDS--PAGE (for Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis). The technique has become a standard means for molecular weight determination.

Polyacrylamide gels are formed from the polymerization of two compounds, acrylamide and N,N^1-methylene- bis-acrylamide (Bis, for short). Bis is a cross-linking agent for the gels. The polymerization is initiated by the addition of ammonium persulfate along with either -dimethyl amino-propionitrile (DMAP) or N,N,N^1,N^1,- tetramethylethylenediamine (TEMED). The gels are neutral, hydrophillic, three-dimensional networks of long hydrocarbons crosslinked by methylene groups.

The separation of molecules within a gel is determined by the relative size of the pores formed within the gel. The pore size of a gel is determined by two factors, the total amount of acrylamide present (designated as %T) and the amount of cross-linker (%C). As the total amount of acrylamide increases, the pore size decreases. With cross- linking, 5%C gives the smallest pore size. Any increase or decrease in %C increases the pore size. Gels are designated as percent solutions and will have two necessary parameters. The total acrylamide is given as a % (w/v) of the acrylamide plus the bis-acrylamide. Thus, a 7 1/2 %T would indicate that there is a total of 7.5 gms of acrylamide and bis per 100 ml of gel. A gel designated as 7.5%T:5%C would have a total of 7.5% (w/v) acrylamide + bis, and the bis would be 5% of the total (with pure acrylamide composing the remaining 2.5%).

Proteins with molecular weights ranging from 10,000 to 1,000,000 may be separated with 7 1/2% acrylamide gels, while proteins with higher molecular weights require lower acrylamide gel concentrations. Conversely, gels up to 30% have been used to separate small polypeptides. The higher the gel concentration, the smaller the pore size of the gel and the better it will be able to separate smaller molecules. The percent gel to use depends on the molecular weight of the protein to be separated. Use 5% gels for proteins ranging from 60,000 to 200,000 daltons, 10% gels for a range of 16,000 to 70,000 daltons and 15% gels for a range of 12,000 to 45,000 daltons. 3

Cationic vs anionic systems

In electrophoresis, proteins are separated on the basis of charge, and the charge of a protein can be either + or -- , depending upon the pH of the buffer. In normal operation, a column of gel is partitioned into three sections, known as the Separating or Running Gel, the Stacking Gel and the Sample Gel. The sample gel may be eliminated and the sample introduced via a dense non-convective medium such as sucrose. Electrodes are attached to the ends of the column and an electric current passed through the partitioned gels. If the electrodes are arranged in such a way that the upper bath is -- (cathode), while the lower bath is + (anode), and -- anions are allowed to flow toward the anode, the system is known as an anionic system. Flow in the opposite direction, with + cations flowing to the cathode is a cationic system.

Tube vs Slab Systems


Figure 4.2 Electrophoretic separations of proteins

Two basic approaches have been used in the design of electrophoresis protocols. One, column electrophoresis, uses tubular gels formed in glass tubes, while the other, slab gel electrophoresis, uses flat gels formed between two plates of glass. Tube gels have an advantage in that the movement of molecules through the gels is less prone to lateral movement and thus there is a slightly improved resolution of the bands, particularly for proteins. It is also more economical, since it is relatively easy to construct homemade systems from materials on hand. However, slab gels have the advantage of allowing for two dimensional analysis, and of running multiple samples simultaneously in the same gel.

Slab gels are designed with multiple lanes set up such that samples run in parallel. The size and number of the lanes can be varied and, since the samples run in the same medium, there is less likelihood of sample variation due to minor changes in the gel structure. Slab gels are unquestionably the the technique of choice for any blot analyses and for autoradiographic analysis. Consequently, for laboratories performing routine nucleic acid analyses, and those employing antigenic controls, slab gels have become standard. The availability of reasonably priced commercial slab gel units has increased the use of slab gel systems, and the use of tube gels is becoming rare.

The theory and operation of slab gel electrophoresis is identical to tube gel electrophoresis. Which system is used depends more on the experience of the investigator than on any other factor, and the availability of equipment.

Figure 4.2 presents a typical protein separation pattern.

Continuous vs discontinuous gel systems


Figure 4.3 Schematic diagram of electrophoresis

The original use of gels as separating media involved using a single gel with a uniform pH throughout. Molecules were separated on the basis of their mobility through a single gel matrix. This system has only occasional use in today's laboratory. It has been replaced with discontinous, 4 multiple gel systems. In multiple gel systems, a separating gel is augmented with a stacking gel and an optional sample gel. These gels can have different concentrations of the same support media, or may be completely different agents. The key difference is how the molecules separate when they enter the separating gel. The proteins in the sample gel will concentrate into a small zone in the stacking gel before entering the separating gel. The zone within the stacking gel can range in thickness from a few microns to a full millimeter. As the proteins are stacked in concentrated bands, they continue to migrate into the separating gel in concentrated narrow bands. The bands then are separated from each other on a discontinuous (i.e. disc ) pH gel. 5

Once the protein bands enter the separating gel, separation of the bands is enhanced by ions passing through the gel column in pairs. Each ioin in the pair has the same charge polarity as the protein (usually negative), but differ in charge magnitude. One ion will have a much greater charge magnitude than the proteins, while the other has a lesser charge magnitude than the proteins. The ion having a greater charge will move faster and is thus the leading ion, while the ion with the lesser charge will be the trailing ion. When an anionic system is employed, the Cl¯ and glycinate (glycine as its acid derivative) ions are derived from the reservoir buffer (Tris-Glycine). The leading ion is usually Cl¯ glycinate is the trailing ion. A schematic of this anionic system is shown in Figure 4.3. Chloride ions enter the separating gel first and rapidly move down the gel, followed by the proteins and then the glycinate ions. The glycinate ions overtake the proteins and ultimately establish a uniform linear voltage gradient within the gel. The proteins then sort themselves within this gradient according to their charge and size.

Agarose Gels


Figure 4.4 Agarose separation of cDNA

While acrylamide gels have become the standard for protein analysis, they are less suitable for extremely high molecular weight nucleic acids (above 200,000 daltons). In order to properly separate these large molecules, the acrylamide concentration needs to be reduced to a level where it remains liquid.

The gels can be formed, however, by the addition of agarose, a naturally linear polysaccharide, to the low concentration of acrylamide. With the addition of agarose, acrylamide concentrations of 0.5% can be used and molecular weights of up to 3.5 x 10^6 daltons can be separated. This is particularly useful for the separation of large sequences of DNA. Consequently, agarose-acrylamide gels are used extensively in today's genetic laboratories for the determination of gene maps. This chapter will concentrate on the separation of proteins, but Figure 4.4 demonstrates the separation of DNA fragments on an agarose gel.

Return to Table of Contents

Cell Biology Laboratory Manual
Dr. William H. Heidcamp, Biology Department, Gustavus Adolphus College,
St. Peter, MN 56082 -- [e-mail]

Kết quả (Việt) 1:

Chương 4: Điện - giới thiệuCon số 4.1 Hoefer SE 400 chắc chắn hơn điện đơn vịĐiện có thể là các kỹ thuật chính cho tách phân tử trong phòng thí nghiệm sinh học di động ngày nay. Bởi vì nó là một kỹ thuật mạnh mẽ, và được hợp lý dễ dàng và rẻ tiền, nó đã trở thành phổ biến. Mặc dù thể chất arrangments nhiều cho các cơ quan, và bất kể các phương tiện mà qua đó các phân tử được cho phép để di chuyển, đứt electrophoretic tất cả phụ thuộc vào sự phân bố phí của các phân tử được tách ra. 1Điện có thể là một chiều (tức là một mặt phẳng của chia ly) hoặc hai chiều. Một chiều điện được sử dụng cho hầu hết thường xuyên protein và các axít nucleic đứt. Hai chiều ly thân của protein được sử dụng cho ngón tay in ấn, và khi đúng cách xây dựng có thể cực kỳ chính xác trong việc giải quyết tất cả các protein tồn tại trong một tế bào (lớn hơn 1.500).Các phương tiện hỗ trợ cho điện có thể được hình thành vào một gel trong một ống hoặc nó có thể được lớp vào tấm phẳng. Các ống được sử dụng để dễ dàng một chiều đứt (gần như bất cứ ai có thể làm cho bộ máy riêng của họ từ vật liệu rẻ tiền được tìm thấy trong bất kỳ phòng thí nghiệm), trong khi các tấm có một diện tích bề mặt lớn hơn và tốt hơn cho hai chiều đứt. Con số 4.1 cho thấy một điển hình tấm điện đơn vị.Khi chất tẩy rửa dùng mũi SDS (natri dodecyl sunfat) 2 được sử dụng với protein, tất cả các protein trở thành tiêu cực bị của tập tin đính kèm để dùng mũi SDS anion. Khi tách ra trên một gel polyacrylamide, thủ tục viết tắt là dùng mũi SDS - trang (đối với natri Dodecyl sunfat PolyAcrylamide Gel điện). Các kỹ thuật đã trở thành một phương tiện tiêu chuẩn để xác định trọng lượng phân tử.Polyacrylamide gel được hình thành từ trùng hợp của hai hợp chất, acrylamide và N, N ^ 1-mêtylen-bis-acrylamide (Bis, cho ngắn). Bis là một đại lý cross-linking cho các gel. Sự trùng hợp bắt đầu bằng cách bổ sung ammonium persulfate cùng với một trong hai - Dimetyl amin-propionitrile (DMAP) hoặc N, N, N ^ N 1, ^ 1,-tetramethylethylenediamine (TEMED). Các gel có thái độ trung lập, hydrophillic, mạng lưới ba chiều dài hydrocarbon crosslinked bởi mêtylen nhóm.Sự chia tách của các phân tử trong vòng một gel được xác định bởi kích thước tương đối của các lỗ chân lông được hình thành trong gel. Kích thước lỗ chân lông của một gel được xác định bởi hai yếu tố, tổng số tiền của acrylamide hiện nay (chỉ định là %T) và số lượng cross-linker (%C). Khi tổng số tiền acrylamide tăng, giảm kích thước lỗ chân lông. Với cross - liên kết, 5 %C cho các nhỏ lỗ chân lông kích thước. Bất kỳ tăng hoặc giảm trong %C tăng kích thước lỗ chân lông. Gel được chỉ định là phần trăm các giải pháp và sẽ có hai tham số cần thiết. Acrylamide tất cả được cho là một % (w/v) acrylamide cộng với bis-acrylamide. Do đó, một %T 7 1/2 sẽ cho thấy rằng có là một tổng số là 7,5 g của acrylamide và bis mỗi 100 ml gel. Một gel xác định là 7.5%T:5%C sẽ có tổng cộng 7,5% (w/v) acrylamide + bis, và bis sẽ là 5% tổng số (với tinh khiết acrylamide soạn 2,5% còn lại).Protein với trọng lượng phân tử từ 10.000 tới 1.000.000 có thể được tách bằng 7 1/2% acrylamide gel, trong khi protein với trọng lượng phân tử cao hơn yêu cầu acrylamide gel nồng độ thấp hơn. Ngược lại, sáp bọt dùng lên đến 30% đã được sử dụng để tách nhỏ polypeptid. Cao hơn nồng độ gel, các nhỏ lỗ chân lông kích thước của gel và thì tốt hơn nó sẽ có thể để tách các phân tử nhỏ hơn. Gel phần trăm để sử dụng phụ thuộc vào trọng lượng phân tử protein được tách ra. Sử dụng 5% Gel cho protein khác nhau, từ 60,000 đến 200,000 Dalton, 10% Gel cho một phạm vi của 16.000 tới 70,000 Dalton và 15% Gel cho một loạt các 12.000 đến 45.000 Dalton. 3Cation vs anion hệ thốngTrong điện, protein được tách ra trên cơ sở phí và phí một protein có thể là + hoặc -, tùy thuộc vào độ pH của bộ đệm. Trong hoạt động bình thường, một cột của gel phân chia thành ba phần, được gọi là Separating hoặc chạy Gel, xếp chồng Gel và mẫu Gel. Gel mẫu có thể được loại bỏ và mẫu giới thiệu thông qua một phương tiện phòng không nhô dày đặc như Sucroza. Điện cực được gắn liền với kết thúc của các cột và một dòng điện đi qua partitioned gel. Nếu các điện cực được sắp xếp theo cách mà tắm trên là--(cathode), trong khi tắm thấp là + (anode), và--anion được phép chảy về hướng cực dương, Hệ thống được gọi là một hệ thống anion. Chảy theo hướng đối diện, với + cation chảy để cực âm là một hệ thống cation.Hệ thống sàn ống vsCon số 4.2 Electrophoretic đứt của proteinHai phương pháp tiếp cận cơ bản đã được sử dụng trong thiết kế của giao thức điện. Một cột điện, sử dụng gel hình ống được hình thành trong ống kính, trong khi khác, xúc xích nhiều gel điện, sử dụng phẳng gel hình thành giữa hai tấm kính. Ống gel có một lợi thế trong đó sự chuyển động của các phân tử thông qua các gel là ít dễ bị bên di chuyển và do đó có một độ phân giải hơi cải tiến của các ban nhạc, đặc biệt là cho protein. Nó cũng là kinh tế hơn, vì nó là tương đối dễ dàng để xây dựng các hệ thống tự làm từ vật liệu mặt. Tuy nhiên, tấm gel có lợi thế của việc cho phép cho hai phân tích chiều, và chạy nhiều mẫu đồng thời trong cùng một gel.Tấm gel được thiết kế với nhiều làn xe thiết lập sao cho mẫu chạy song song. Kích thước và số lượng các tuyến đường có thể khác nhau, và kể từ khi các mẫu chạy trong môi trường tương tự, đó là ít hơn khả năng của mẫu biến thể do các thay đổi nhỏ trong cấu trúc gel. Tấm gel có unquestionably các kỹ thuật của sự lựa chọn cho bất kỳ phân tích blot và phân tích autoradiographic. Do đó, cho phòng thí nghiệm thực hiện phân tích axít nucleic thường xuyên, và những người sử dụng điều khiển kháng nguyên, tấm gel đã trở thành tiêu chuẩn. Sự sẵn có của giá cả hợp lý thương mại tấm gel đơn vị đã tăng việc sử dụng các tấm gel hệ thống, và việc sử dụng các ống gel ngày càng trở nên hiếm.Lý thuyết và hoạt động của tấm gel điện là giống hệt nhau để ống gel điện. Những hệ thống được sử dụng phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm của các điều tra viên hơn trên bất kỳ yếu tố nào khác, và sự sẵn có của thiết bị.Con số 4,2 trình bày một mô hình điển hình protein tách.Liên tục vs gián đoạn gel hệ thốngHình 4.3 sơ sơ đồ của điệnViệc sử dụng bản gốc của gel là tách phương tiện truyền thông tham gia bằng cách sử dụng một gel duy nhất với một vn thống nhất trong suốt. Phân tử đã được tách ra trên cơ sở của tính di động thông qua một ma trận đơn gel. Hệ thống này có chỉ không thường xuyên sử dụng trong phòng thí nghiệm của ngày hôm nay. Nó đã thay thế bằng discontinous, 4 nhiều gel hệ thống. Trong nhiều gel hệ thống, một tách gel tăng cường với một gel xếp chồng và một gel tùy chọn mẫu. Các gel có thể có các nồng độ khác nhau của các phương tiện truyền thông hỗ trợ tương tự, hoặc có thể là hoàn toàn khác nhau đại lý. Sự khác biệt quan trọng là làm thế nào các phân tử riêng biệt khi họ nhập tách gel. Các protein trong các mẫu gel sẽ tập trung vào một khu vực nhỏ trong gel xếp trước khi vào tách gel. Khu vực trong vòng xếp gel có thể dao động độ dày từ vài micron để một mm đầy đủ. Như các protein được xếp chồng lên nhau trong tập trung ban nhạc, họ tiếp tục di chuyển vào tách gel trong dải hẹp tập trung. Các ban nhạc sau đó được ngăn cách với nhau trên một gián đoạn (tức là đĩa) pH gel. 5Một khi các ban nhạc protein nhập tách gel, tách biệt của các ban nhạc được tăng cường bởi các ion đi qua cột gel trong cặp. Mỗi ioin trong các cặp đã cực phí tương tự như các protein (thường phủ định), nhưng khác nhau ở phí cường độ. Một ion sẽ có một cấp sao biểu kiến phí lớn hơn nhiều so với các protein, trong khi khác có một cấp sao biểu kiến phí thấp hơn so với các protein. Ion có một khoản phí lớn hơn sẽ di chuyển nhanh hơn và do đó là ion hàng đầu, trong khi các ion với chi phí thấp hơn sẽ là các ion dấu. Khi một hệ thống anionic được sử dụng, Cl¯ và glycinate (glycine như của nó dẫn xuất axit) các ion có nguồn gốc từ các hồ chứa bộ đệm (Tris-Glycine). Các ion hàng đầu thường là Cl¯ glycinate là ion dấu. Một sơ đồ hệ thống anion này hiển thị trong hình 4.3. Các ion clorua nhập tách gel đầu tiên và nhanh chóng di chuyển xuống các gel, theo sau là các protein và sau đó các ion glycinate. Các ion glycinate vượt qua các protein và cuối cùng thiết lập một gradient áp tuyến tính thống nhất trong gel. Các protein sau đó sắp xếp mình trong này gradient theo phí và kích thước của họ.Agarose gelCon số 4.4 Agarose tách cDNATrong khi acrylamide gel đã trở thành tiêu chuẩn cho phân tích protein, họ đang ít phù hợp cho axít nucleic trọng lượng phân tử rất cao (trên 200.000 Dalton). Để chính xác tách rời các phân tử lớn, tập trung acrylamide cần phải được giảm đến một mức độ mà nó vẫn là chất lỏng.Các gel có thể được thành lập, Tuy nhiên, bằng cách bổ sung agarose, một polysacarit tuyến tính tự nhiên với nồng độ thấp của acrylamide. Với việc bổ sung các agarose, acrylamide nồng độ 0,5% có thể là sử dụng và phân tử trọng lượng lên đến 3,5 x 10 ^ Dalton 6 có thể được tách ra. Điều này đặc biệt hữu ích cho sự phân chia lớn các chuỗi DNA. Do đó, agarose-acrylamide gel được sử dụng rộng rãi trong ngày hôm nay của phòng thí nghiệm di truyền cho việc xác định bản đồ gen. Chương này sẽ tập trung vào sự chia tách của protein, nhưng con số 4.4 chứng tỏ sự chia tách của mảnh DNA trên một gel agarose.Quay lại bảng nội dung Hướng dẫn sử dụng phòng thí nghiệm sinh học tế bàoTiến sĩ William H. Heidcamp, bộ phận sinh học, Gustavus Adolphus College,St. Peter, MN 56082 - [e-mail]

Kết quả (Việt) 2:

Chương 4: Điện di - Giới thiệu Hình 4.1 Hoefer SE 400 đơn vị chắc chắn hơn điện di Điện di có thể là kỹ thuật chính để tách phân tử trong phòng thí nghiệm sinh học tế bào ngày nay. Bởi vì nó là một kỹ thuật mạnh mẽ như vậy, và chưa hợp lý dễ dàng và không tốn kém, nó đã trở thành phổ biến. Mặc dù các arrangments thể chất nhiều cho bộ máy, và không phụ thuộc vào môi trường mà các phân tử được phép di chuyển, tất cả sự phân ly điện di phụ thuộc vào sự phân bố phụ trách các phân tử bị tách. 1 điện di có thể là một chiều (tức là một mặt phẳng tách) hoặc hai chiều. Một điện chiều được sử dụng cho hầu hết các protein thường xuyên và phân ly axit nucleic. Hai tách chiều của protein được sử dụng để in ấn ngón tay, và khi đúng cách xây dựng có thể cực kỳ chính xác trong việc giải quyết tất cả các protein hiện diện trong một tế bào (hơn 1.500). Các phương tiện hỗ trợ cho điện có thể hình thành một chất gel trong một ống hoặc nó có thể bị phân lớp thành tấm phẳng. Các ống này được sử dụng để dễ dàng một ly chiều (gần bất cứ ai có thể làm cho bộ máy của mình từ các nguyên liệu rẻ tiền được tìm thấy trong bất kỳ phòng thí nghiệm), trong khi các bảng tính có một diện tích bề mặt lớn hơn và tốt hơn cho hai ly chiều. Hình 4.1 cho thấy một đơn vị phiến điện điển hình. Khi SDS chất tẩy rửa (sodium dodecyl sulfate) 2 được sử dụng với các protein, tất cả các protein trở nên tích điện âm bởi gắn bó với các anion SDS. Khi tách trên gel polyacrylamide, thủ tục được viết tắt là SDS - PAGE (cho Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide Gel điện di). Kỹ thuật này đã trở thành một phương tiện tiêu chuẩn để xác định trọng lượng phân tử. Gel Polyacrylamide được hình thành từ sự trùng hợp của hai hợp chất, acrylamide và N, N ^ 1-methylene- bis-acrylamide (Bis, cho ngắn). Bis là một tác nhân liên kết ngang với các bản gel. Trùng hợp được bắt đầu bằng việc thêm ammonium persulfate cùng với một trong hai -dimethyl amino-propionitrile (DMAP) hoặc N, N, N ^ 1, N ^ 1, - tetramethylethylenediamine (TEMED). Các gel là trung tính, hydrophillic, mạng lưới ba chiều của các hydrocacbon dài Crosslinked bởi nhóm methylene. Việc tách các phân tử trong một gel được xác định bởi kích thước tương đối của các lỗ chân lông được hình thành trong gel. Các kích thước lỗ của một loại gel được xác định bởi hai yếu tố, tổng số lượng acrylamide hiện nay (chỉ định là% T) và số tiền của cross-liên kết (% C). Là tổng số tiền của acrylamide tăng, kích thước lỗ giảm. Với chéo liên kết, 5% C cho các kích thước lỗ nhỏ nhất. Việc tăng hoặc giảm% C làm tăng kích thước lỗ chân lông. Gel được chỉ định là giải pháp phần trăm và sẽ có hai thông số cần thiết. Tổng acrylamide được đưa ra như một% (w / v) của acrylamide cộng với bis-acrylamide. Như vậy, một 7 1/2% T sẽ cho thấy rằng có tổng cộng 7,5 gms của acrylamide và bis mỗi 100 ml gel. Một loại gel chỉ định là 7,5% T: 5% C sẽ có tổng cộng 7,5% (w / v) acrylamide + bis, và bis sẽ là 5% tổng số (với acrylamide tinh khiết sáng tác còn lại 2,5%). Protein với trọng lượng phân tử khác nhau, từ 10.000 đến 1.000.000 có thể được tách ra với 7 1/2% gel acrylamide, trong khi protein có trọng lượng phân tử cao hơn đòi hỏi nồng độ gel acrylamide thấp hơn. Ngược lại, gel lên đến 30% đã được sử dụng để tách các polypeptide nhỏ. Các cao hơn nồng độ gel, nhỏ hơn kích thước lỗ gel và tốt hơn nó sẽ không có thể tách các phân tử nhỏ hơn. Các gel phần trăm sử dụng phụ thuộc vào trọng lượng phân tử của protein được tách ra. Sử dụng 5% gel cho các protein khác nhau, từ 60.000 đến 200.000 dalton, 10% gel cho một phạm vi 16.000 đến 70.000 dalton và 15% gel cho một phạm vi của 12.000 đến 45.000 dalton. 3 Cationic vs anion hệ thống Trong điện di protein được tách ra trên cơ sở phí, và phụ trách một protein có thể là + hoặc -, tùy thuộc vào độ pH của bộ đệm. Trong hoạt động bình thường, một cột gel được phân chia thành ba phần, được gọi là tách hoặc Chạy Gel, Gel Stacking và Gel mẫu. Các gel mẫu có thể được loại bỏ và các mẫu được giới thiệu thông qua một môi trường không đối lưu dày đặc như sucrose. Các điện cực được gắn vào hai đầu của cột và một dòng điện đi qua các bản gel phân vùng. Nếu các điện cực được sắp xếp theo một cách như vậy mà tắm trên là - (cathode), trong khi tắm dưới là + (anode), và - anion được phép lưu thông về phía anode, hệ thống được biết đến như một hệ thống anion . Chảy theo hướng ngược lại, với + cation chảy sang catôt là một cation hệ thống. Ống vs Hệ thống Sàn Hình 4.2 ly Điện di protein Hai cách tiếp cận cơ bản đã được sử dụng trong các thiết kế của giao thức điện. Một, cột điện, sử dụng gel ống hình thành trong ống kính, trong khi khác, gel phiến điện, sử dụng gel phẳng hình thành giữa hai tấm kính. Gel ống có một lợi thế trong sự vận động của các phân tử thông qua các bản gel là ít bị di chuyển bên và do đó có một độ phân giải được cải thiện đôi chút trong những ban nhạc, đặc biệt là đối với các protein. Đó cũng là kinh tế hơn, vì nó là tương đối dễ dàng để xây dựng hệ thống tự chế từ tài liệu trên tay. Tuy nhiên, gel phiến có lợi thế là cho phép phân tích hai chiều, và chạy nhiều mẫu đồng thời trong cùng một gel. Gel Sàn được thiết kế với nhiều làn đường thiết lập như vậy mà mẫu xe chạy song song. Các kích thước và số lượng các làn xe có thể thay đổi, và từ các mẫu xe chạy trong cùng một môi trường, ít có khả năng biến đổi mẫu do những thay đổi nhỏ trong cấu trúc gel. Gel Slab là nghi ngờ gì nữa các kỹ thuật được chọn cho bất kỳ blot phân tích và phân tích autoradiographic. Do đó, các phòng thí nghiệm thực hiện axit nucleic thói quen phân tích, và những người sử dụng điều khiển tính kháng nguyên, gel phiến đã trở thành tiêu chuẩn. Tính sẵn có của giá cả hợp lý các đơn vị gel sàn thương mại đã tăng việc sử dụng các hệ thống gel sàn, và việc sử dụng gel ống đang trở thành hiếm. Các lý thuyết và hoạt động của gel electrophoresis slab là giống hệt nhau để gel ống điện. Mà hệ thống được sử dụng phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm của các điều tra viên hơn bất kỳ yếu tố khác, và sự sẵn có của thiết bị. Hình 4.2 trình bày một mô hình tách protein điển hình. Liên tục vs hệ thống gel liên tục Hình 4.3 Sơ đồ của điện Việc sử dụng ban đầu của gel như phương tiện truyền thông liên quan đến sử dụng một tách gel duy nhất với độ pH đều khắp. Phân tử đã được tách ra trên cơ sở của tính di động của mình thông qua một ma trận gel duy nhất. Hệ thống này chỉ có thường xuyên sử dụng trong phòng thí nghiệm của ngày hôm nay. Nó đã được thay thế bằng discontinous, 4 nhiều hệ gel. Trong nhiều hệ thống gel, gel tách được tăng lên với một gel xếp chồng và một gel mẫu tùy chọn. Những loại gel có thể có nồng độ khác nhau của các phương tiện truyền thông hỗ trợ tương tự, hoặc có thể được các đại lý hoàn toàn khác nhau. Sự khác biệt chính là cách các phân tử riêng biệt khi họ vào gel tách. Các protein trong gel mẫu sẽ tập trung vào một khu vực nhỏ trong gel xếp chồng trước khi vào gel tách. Các khu trong gel xếp chồng có thể dao động trong độ dày từ vài micron để milimet đầy đủ. Khi protein được xếp chồng lên nhau trong các ban nhạc tập trung, họ tiếp tục di chuyển vào gel tách trong dải hẹp tập trung. Các ban nhạc sau đó được tách khỏi nhau trên không liên tục (tức là đĩa) gel pH. 5 Khi các băng protein vào gel tách, tách các băng được tăng cường bởi các ion đi qua cột gel trong cặp. Mỗi ioin trong cặp mang cực phí tương tự như protein (thường là tiêu cực), nhưng khác nhau về độ lớn phụ trách. Một ion sẽ có một độ lớn phí lớn hơn nhiều so với các protein, trong khi người kia có độ lớn phí ít hơn so với các protein. Các ion có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển nhanh hơn và vì thế các ion hàng đầu, trong khi các ion với các tội nhẹ hơn sẽ là ion dấu. Khi một hệ thống anion được sử dụng, CL và Glycinate (glycine như phái sinh axit của nó) ion có nguồn gốc từ bộ đệm chứa (Tris-Glycine). Các ion hàng đầu thường là Cl Glycinate là ion dấu. Một sơ đồ của hệ thống anion này được thể hiện trong hình 4.3. Ion clorua nhập gel tách đầu tiên và nhanh chóng di chuyển xuống các gel, tiếp theo là các protein và sau đó các ion Glycinate. Các ion Glycinate vượt qua các protein và cuối cùng là thiết lập một linear gradient điện áp thống nhất trong gel. Các protein sau đó sắp xếp bản thân trong gradient này theo phí và kích thước của chúng. Agarose Gel Hình 4.4 tách Agarose của cDNA Trong khi gel acrylamide đã trở thành tiêu chuẩn để phân tích protein, họ ít thích hợp với trọng lượng phân tử rất cao các axit nucleic (trên 200.000 dalton) . Để đúng cách tách các phân tử lớn, nồng độ acrylamide cần phải được giảm đến một mức độ mà nó vẫn còn lỏng. Các gel có thể được hình thành, tuy nhiên, bằng việc bổ sung các agarose, một polysaccharide tự nhiên tuyến tính, với nồng độ thấp của acrylamide. Với sự bổ sung của agarose, nồng độ acrylamide 0,5% có thể được sử dụng và trọng lượng phân tử lên đến 3,5 x 10 ^ 6 dalton có thể được tách ra. Điều này đặc biệt hữu dụng cho việc tách các chuỗi lớn của DNA. Do đó, gel agarose-acrylamide được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm di truyền của ngày hôm nay để xác định bản đồ gen. Chương này sẽ tập trung vào việc phân chia các protein, nhưng Hình 4.4 cho thấy sự tách biệt của các đoạn ADN trên gel agarose. Trở về Mục lục Phòng thí nghiệm Sinh học tế bào bằng tay Dr. William H. Heidcamp, Sinh học Khoa, Gustavus Adolphus College, St. Peter, MN 56.082 - [e-mail]