Rolling circle amplification (RCA)R

Rolling circle amplification (RCA)
RCA is an isothermal method which uses the DNA polymerase of the Bacillus subtilis
bacteriophage phi29 (Φ29), a monomeric enzyme with a molecular mass of about 66
kDa, that possesses a polymerase activity located on the C-terminal domain and two
degradative activities: pyrophosphorolysis (depolymerization), a process for which its
physiological significance is still unclear, and a 3’–5’-exonuclease activity within its Nterminal
domain, involved in proofreading function, resulting in an error rate of only 1
in 106
–107
, approximately 100 times more accurate than Taq DNA polymerase,
which gives an error rate of 1 error in 104
–105
amplified base pairs (Eckert and
Kunkel, 1990).
The enzyme has two other intrinsic properties: high processivity (70 kb) and strand
displacement ability making unnecessary the participation of accessory proteins and
DNA helicases, thus allowing templates as small circular ssDNA to be replicated to
nearly unlimited extent using the rolling circle replication mechanism (Blanco et al.,
1989; Blanco and Salas, 1996; Dean et al., 2001; Garmendia et al., 1992).
During RCA, random hexamer oligonucleotides bind to the DNA, the polymerase
binds to the 3’ end of the oligonucleotides and starts the complementary strand
synthesis. When the polymerase reaches the 5’ end of another hexamer
oligonucleotide, it displaces the strand and continues the amplification process. The
nascent ssDNA is now target for more hexamer oligonucleotides, where more
polymerases can start other amplification processes (Fig. 5).
Figure 5. Mechanism of rolling circle amplification (RCA). Random hexamers (NNNNNN) are hybridized with
circular DNA, and the resulting double-strand segments function as oligonucleotides in the polymerization
reaction carried out by Φ29 DNA polymerase, a unique enzyme with very high strand-displacement activity. As
the 'front' of the extending complementary strand of the plasmid encounters double-stranded portions of DNA, the
advancing new strand displaces the old one from the template. This extension process covers the entire length of
the circular DNA multiple times, resulting in the formation of repeated sequences of the template, called
concatemers. The hexamers also hybridize with these concatemers, which become templates in their own right.
This extension, however, proceeds only until the terminus of the linear concatemer is reached. The result is the
formation of various lengths of double-stranded DNA consisting of repeats of the template sequence. Figure from

Kết quả (Việt) 1:

Lăn tròn khuếch đại (RCA)RCA là một phương pháp cách nhiệt mà sử dụng ADN polymerase của Bacillus subtilisbacteriophage phi29 (Φ29), một loại enzyme monomeric với một khối lượng phân tử của khoảng 66kDa, trong đó có một hoạt động polymerase nằm trên vùng C-ga và haidegradative hoạt động: pyrophosphorolysis (depolymerization), một quá trình mà cáctầm quan trọng sinh lý là vẫn còn chưa rõ ràng, và một hoạt động 3'-5'-exonuclease trong Nterminal của nótên miền, tham gia trong proofreading chức năng, kết quả là một tỷ lệ lỗi chỉ 1trong 106–107, khoảng 100 lần nhiều chính xác hơn Taq DNA polymerase,đó cung cấp cho một tỷ lệ lỗi 1 lỗi trong 104–105khuếch đại cặp cơ sở (Eckert vàKunkel, 1990).Enzyme có hai tính chất nội tại khác: cao processivity (70 kb) và strandtrọng lượng rẽ nước khả năng thực hiện không cần thiết sự tham gia của phụ kiện protein vàDNA helicases, do đó cho phép mẫu như ssDNA tròn nhỏ để được sao chép tớigần như không giới hạn mức độ bằng cách sử dụng các cán tròn rộng cơ chế (Blanco et al.,năm 1989; Blanco và Salas, 1996; Dean et al., năm 2001; Garmendia et al., 1992).Trong RCA, ngẫu nhiên hexamer oligonucleotides liên kết với DNA polymeraseliên kết với 3' cuối của các oligonucleotides và bắt đầu bổ sung strandTổng hợp. Khi polymerase đạt đến 5' cuối của một hexameroligonucleotide, nó displaces sợi và tiếp tục quá trình khuếch đại. CácssDNA non trẻ là bây giờ mục tiêu cho thêm hexamer oligonucleotides, nơi mà nhiều hơn nữapolymerase có thể bắt đầu quá trình khuếch đại khác (hình 5).Hình 5. Cơ cấu của ngọn vòng tròn khuếch đại (RCA). Ngẫu nhiên hexamers (NNNNNN) đang cặp vớiThông tư DNA, và chức năng lõi đôi phân đoạn kết quả như oligonucleotides trong sự trùng hợpphản ứng thực hiện bởi Φ29 DNA polymerase, một loại enzyme duy nhất với rất cao strand-trọng lượng rẽ nước hoạt động. Nhưở mặt trước của the strand bổ sung mở rộng của plasmid gặp đôi-stranded phần DNA, cáctiến mới strand displaces một tuổi từ các mẫu. Quá trình mở rộng này bao gồm toàn bộ chiều dài củaDNA tròn nhiều lần, dẫn đến sự hình thành của lặp đi lặp lại trình tự của các mẫu, gọi làconcatemers. Các hexamers cũng lai với các concatemers, mà trở thành mẫu ở bên phải của riêng họ.Phần mở rộng này, Tuy nhiên, tiền chỉ cho đến khi đạt đến ga cuối của tuyến tính concatemer. Kết quả là cáchình thành của các độ dài khác nhau của đôi-stranded DNA bao gồm lặp đi lặp lại của chuỗi mẫu. Tìm từ

Kết quả (Việt) 2:

Khuếch đại vòng tròn lăn (RCA)
RCA là một phương pháp đẳng nhiệt trong đó sử dụng các polymerase DNA của vi khuẩn Bacillus subtilis
bacteriophage phi29 (Φ29), một enzyme monomeric với một khối lượng phân tử khoảng 66
kDa, mà sở hữu một hoạt động polymerase nằm trên miền C-terminal và hai
hoạt động suy thoái: pyrophosphorolysis (depolymerization), một quá trình mà nó
có ý nghĩa sinh lý vẫn còn chưa rõ ràng, và một hoạt động 3'-5'-exonuclease trong Nterminal của
miền, tham gia vào chức năng soát lỗi, dẫn đến một tỷ lệ lỗi của chỉ 1
trong 106
-107, khoảng 100 lần chính xác hơn Taq DNA polymerase, trong đó cung cấp một tỷ lệ lỗi của 1 lỗi trong 104 -105 cặp base khuếch đại (Eckert và Kunkel, 1990). Các enzym có hai thuộc tính nội tại khác: processivity cao (70 kb ) và sợi khả năng dịch chuyển không cần thiết làm cho sự tham gia của các protein phụ kiện và helicases DNA, do đó cho phép các mẫu nhỏ tròn ssDNA được nhân rộng đến mức gần như không giới hạn sử dụng các cơ chế sao chép hình tròn lăn (Blanco et al,. 1989; Blanco và Salas, 1996; Dean et al., 2001; Garmendia et al., 1992). Trong RCA, oligonucleotide hexame ngẫu nhiên liên kết với DNA, các polymerase gắn với "sự kết thúc 3 của oligonucleotide và bắt đầu các sợi bổ sung tổng hợp. Khi polymerase đạt đến 5 'của một hexame oligonucleotide, nó chiếm chỗ của các sợi và tiếp tục quá trình khuếch đại. Các non trẻ ssDNA hiện đang nhắm mục tiêu cho nhiều oligonucleotide hexame, nơi nhiều polymerase có thể bắt đầu quá trình khuếch đại khác (Fig. 5). Hình 5. Cơ chế khuếch đại vòng tròn lăn (RCA). Hexamers ngẫu nhiên (nnnnnn) được lai với DNA vòng, và các phân đoạn hai sợi dẫn chức năng như oligonucleotide trong trùng hợp phản ứng được thực hiện bởi Φ29 DNA polymerase, một enzyme độc đáo với hoạt động sợi thuyên rất cao. Khi các "mặt trận" của các sợi bổ sung mở rộng của các plasmid gặp phần sợi kép của DNA, các mạch mới tiến chiếm chỗ cũ từ mẫu. Quá trình mở rộng này bao gồm toàn bộ chiều dài của thông tư lần nhiều DNA, dẫn đến sự hình thành của các trình tự lặp đi lặp lại của các mẫu, được gọi là concatemers. Các hexamers cũng lai với những concatemers, mà trở thành hình mẫu trong quyền riêng của họ. Phần mở rộng này, tuy nhiên, tiền thu được chỉ cho đến ga cuối của concatemer tuyến tính là đạt. Kết quả là hình thành các độ dài khác nhau của DNA sợi kép gồm lặp đi lặp lại của chuỗi mẫu. Hình từ