2.2. Insect dissectionLarvae were f

2.2. Insect dissection
Larvae were from a laboratory culture reared
continuously on 95% wheat flour mixed with 5%
brewers yeast. At the time of dissection, larvae
weighed an average of 3.11"0.50 mg (average of
5 groups of 10 larvae each, mean"S.D.). Larvae
were chilled on ice, the posterior and anterior ends
were removed, and entire guts were excised,
pooled in deionized water (10 gutsy25 ml for
proteinase assays, or 10 guts per 50 ml for pH
measurements taken prior to freezing), and frozen
at y20 8C. For microplate proteinase assays,
samples were thawed, vortexed briefly, and the
supernatant was collected following centrifugation
at 15 000=g for 5 min.
2.3. Microplate proteinase assay
Analysis of proteinase activities in vitro was
performed with a microplate assay (Oppert et al.,
1997). To analyze the effect of pH on proteinase
activity, 0.8 gut equivalent was diluted into 90 ml
of universal buffer (Frugoni, 1957), composed of
phosphoric, acetic, and boric acids mixed with
potassium chloride to obtain buffers with pH
values from acidic to basic. Because reducing
conditions resulted in increased activity, 5 mM L -
cysteine was added to all buffers. A general
enzyme substrate, fluorescently labeled casein
(BODIPY-TR-X casein, Molecular Probes,
Eugene, OR), was diluted as per the manufactur-
er’s recommendation, and 10 ml (0.1 mg) was
added to each well. Each sample was incubated in
triplicate at 37 8C, and the fluorescence was
measured (excitation wavelengths584 nm, emis-
484 B. Oppert et al. / Comparative Biochemistry and Physiology Part C 134 (2003) 481–490
sion wavelengths620 nm) and corrected by sub-
tracting readings obtained from incubations of
substrate only. Measurements of enzyme and buffer
or buffer only produced negligible fluorescence.
For inhibition assays, proteinase inhibitors were
added to pH 4.2 buffer with 5 mM L -cysteine and
preincubated with the gut extract for 30 min at 37
8C prior to the addition of substrate. Inhibition
was measured after 4 h incubation at 37 8C. The
percent inhibition was calculated using linear
regression of data points.
Synthetic substrates conjugated to r-nitroanilide
obtained from Sigma included N-a-benzoyl- L -argi-
nine r-nitroanilide (BApNA) and N-succinyl ala-
ala-pro-phe r-nitroanilide (SAAPFpNA).
Substrates were diluted to a final concentration of
1 mgyml in 50 ml of universal buffer with pH
values ranging from acidic to basic (Frugoni
1957). To initiate the reaction, 2 gut equivalents
of T. castaneum larval gut proteinases diluted in
50 ml of the appropriate buffer were added to each
well. Triplicate samples were incubated at 37 8C
for 5 min, and absorbance at 405 nm was moni-
tored at 15-s intervals. The change in absorbance
per min was calculated by KinetiCalc3 software
(BIO-TEK, Winooski, VT) and the data were
reported in milliabsorbance units per min per gut
equivalent, after subtracting the amount of absorb-
ance contributed by autolysis of the substrate.

Kết quả (Việt) 1:

2.2. côn trùng mổ xẻẤu trùng từ một nền văn hóa của phòng thí nghiệm nuôiliên tục trên 95% lúa mì bột trộn với 5%nấm men bia. Tại thời điểm mổ xẻ, ấu trùngcân nặng trung bình là 3,11" 0,50 mg (trung bình của5 nhóm 10 ấu trùng mỗi, mean"S.D). Ấu trùngđược ướp lạnh trên băng, sau và trước kết thúcđã loại bỏ, và toàn bộ ruột đã excised,gộp trong deionized nước (10 gutsy25 ml choProteinase thử nghiệm, hoặc 10 ruột mỗi 50 ml cho độ pHđo đạc thực hiện trước khi đóng băng), và đông lạnhlúc y20 8C. Cho các thử nghiệm proteinase microplate,mẫu được xả đá, vortexed một thời gian ngắn, và cácsupernatant đã được thu thập sau sốlúc 15 000 = g cho 5 phút.2.3. Microplate proteinase khảo nghiệmPhân tích của proteinase hoạt động trong ống nghiệmthực hiện với một khảo nghiệm microplate (Oppert và ctv.,Năm 1997). để phân tích ảnh hưởng của pH proteinasehoạt động, cách 0.8 ruột equivalent được pha loãng vào 90 mluniversal đệm (Frugoni, 1957), bao gồmphosphoric, axetic và boric acid trộn vớiclorua kali để có được các bộ đệm với pHgiá trị từ axít để cơ bản. Bởi vì việc giảmđiều kiện dẫn đến tăng cường hoạt động, 5 mM L-cysteine đã được thêm vào tất cả các bộ đệm. Một vị tướngenzym bề mặt, có nhãn fluorescently casein(BODIPY-TR-X casein, phân tử đầu dò,Eugene, OR), được pha loãng theo manufactur -er của đề nghị, và 10 ml (cách 0.1 mg) làThêm vào mỗi tốt. Mỗi mẫu được ủ trongtriplicate lúc 37 8 c, và sự phát huỳnh quang làđo (kích thích wavelengths584 nm, emis-484 B. Oppert et al. / so sánh hóa sinh và sinh lý học phần C 134 (2003) 481-490Sion wavelengths620 nm) và sửa chữa bởi sub -tracting đọc thu được từ incubations củabề mặt. Các số đo của enzym và bộ đệmhoặc đệm chỉ tạo ra sự phát huỳnh quang không đáng kể.Cho thử nghiệm sự ức chế, proteinase ức chếThêm vào bộ đệm pH 4.2 với 5 mM L-cystein vàpreincubated với các chiết xuất ruột trong 30 phút tại 378C trước khi việc bổ sung các chất nền. Ức chếđã được đo sau khi 4 h ủ bệnh lúc 37 8C. Cácphần trăm ức chế đã được tính toán bằng cách sử dụng tuyến tínhhồi quy điểm dữ liệu.Tổng hợp chất kết để r-nitroanilidethu được từ Sigma bao gồm N một benzoyl L - argi-chín r-nitroanilide (BApNA) và N-succinyl ala-Ala-pro-phe r-nitroanilide (SAAPFpNA).Chất nền đã được pha loãng với một nồng độ cuối cùng củamgyml 1 trong 50 ml của universal đệm với pHgiá trị khác nhau, từ axít đến cơ bản (FrugoniNăm 1957). để bắt đầu phản ứng, 2 ruột tương đươngcủa T. castaneum ấu trùng ruột proteinases pha loãng trong50 ml của bộ đệm thích hợp đã được thêm vào cho mỗitốt. Triplicate mẫu đã được ủ tại 37 8 ccho 5 phút, và hấp thu tại 405 nm là moni -tored khoảng thời gian 15-s. Sự thay đổi trong hấp thucho mỗi phút đã được tính toán bởi KinetiCalc3 phần mềm(Sinh học-TEK, Winooski, VT) và dữ liệu đãbáo cáo trong milliabsorbance đơn vị cho mỗi phút cho một ruộttương đương, sau khi trừ đi số lượng absorb-ance đóng góp của autolysis của bề mặt.

Kết quả (Việt) 2:

2.2. Côn trùng mổ xẻ
Ấu trùng là từ một nền văn hóa phòng thí nghiệm nuôi
liên tục trên 95% bột mì trộn với 5%
men bia. Tại thời điểm bóc tách, ấu trùng
nặng trung bình 3,11 "0,50 mg (trung bình của
5 nhóm mỗi 10 ấu trùng, có nghĩa là "SD). Ấu trùng
được ướp lạnh trên băng, sau và phía trước kết thúc
đã được gỡ bỏ, và toàn bộ ruột được cắt,
gộp lại trong nước khử ion (10 gutsy25 ml cho
xét nghiệm proteinase, hoặc 10 ruột mỗi 50 ml cho pH
đo thực hiện trước khi đông lạnh), và đông lạnh
tại Y20 8C. Đối với xét nghiệm microplate proteinase,
các mẫu được giải đông, vortexed một thời gian ngắn, và
gạn được thu thập sau khi ly tâm
ở 15 000 = g trong 5 phút.
2.3. Microplate proteinase khảo nghiệm
Phân tích hoạt động proteinase trong ống nghiệm được
thực hiện với một khảo nghiệm microplate (Oppert et al,.
1997). Để phân tích ảnh hưởng của pH đến proteinase
hoạt động, 0,8 ruột tương đương đã được pha loãng thành 90 ml
của bộ đệm phổ quát (Frugoni, 1957), gồm
phosphoric, axetic và axit boric trộn với
kali clorua để có được bộ đệm với pH
giá trị từ axit để cơ bản . Bởi vì việc giảm
các điều kiện dẫn đến gia tăng hoạt động, 5 mM L -
cysteine ​​được thêm vào tất cả các bộ đệm. A nói chung
chất nền enzyme, casein huỳnh quang dán nhãn
(BODIPY-TR-X casein, Molecular Probes,
Eugene, OR), được pha loãng theo manufactur-
khuyến er, và 10 ml (0.1 mg) đã được
thêm vào mỗi giếng. Mỗi mẫu được ủ trong
ba lần tại 37 8C, và sự phát huỳnh quang được
đo (kích thích wavelengths584 nm, lượng phát thải
484 B. Oppert et al. / so sánh Hóa sinh và Sinh lý học Phần C 134 (2003) 481-490
sion wavelengths620 nm) và sửa chữa bằng cách phụ
đọc tracting thu được từ nuôi cấy các
chỉ chất nền. Các phép đo của enzyme và đệm
hoặc đệm chỉ được sản xuất huỳnh quang không đáng kể.
Đối với xét nghiệm ức chế, chất ức chế proteinase được
thêm vào để pH 4,2 đệm với 5 mM L -cysteine ​​và
preincubated với chiết xuất đường ruột cho 30 phút ở 37
8C trước khi việc bổ sung các chất nền. Sự ức chế
được đo sau 4 h ủ ở 37 8C. Việc
ức chế phần trăm đã được tính toán bằng cách sử dụng tuyến tính
hồi quy của các điểm dữ liệu.
chất tổng hợp liên hợp với r-nitroanilide
thu được từ Sigma bao gồm Na-benzoyl- L -argi-
chín r-nitroanilide (BApNA) và N-succinyl ala-
ala-pro-phe r -nitroanilide (SAAPFpNA).
Các chất nền đã được pha loãng đến nồng độ cuối cùng của
1 mgyml trong 50 ml dung dịch đệm pH phổ quát với
các giá trị khác nhau, từ tính axit để cơ bản (Frugoni
1957). Để bắt đầu phản ứng, 2 tương đương ruột
của T. castaneum proteinases ruột ấu trùng pha loãng trong
50 ml dung dịch đệm thích hợp đã được thêm vào mỗi
giếng. Mẫu ba lần được ủ ở 37 8C
trong 5 phút, và hấp thụ ở 405 nm là moni-
tored tại 15-s khoảng. Sự thay đổi độ hấp thụ
mỗi phút đã được tính toán bằng phần mềm KinetiCalc3
(BIO-TEK, Winooski, VT) và các dữ liệu đã được
báo cáo trong các đơn vị milliabsorbance mỗi phút mỗi ruột
tương đương, sau khi trừ số tiền absorb-
ance góp của autolysis của bề mặt.