Bst DNA Polymerase Activity AssaysB

Bst DNA Polymerase Activity Assays
Bst DNA polymerase activity was determined by a cDNA synthesis reaction using a synthetic single-stranded template and primer complementary to a portion of the template. Detection of the cDNA strand was accomplished by hybridizing the polymerase product with an acridinium ester-labeled probe designed to be complementary to the cDNA strand. The labeled double-stranded hybrid was detected using the hybridization protection assay (HPA) as described in Arnold et al., Clin. Chem. 35:1588-1594 (1989) and Arnold et al., U.S. Pat. No. 5,283,174, the latter of which enjoys common ownership with the present application and both of which are hereby incorporated by reference herein. The sample suspected of containing Bst DNA polymerase was incubated in a reaction mixture containing 50 mM Tris (pH 7.5), 25 mM KCl, 4 mM MgCl2, 2 mM spermidine, 0.2 mM each dNTP at 60° C. for 8 minutes with 20 fmol of an 86 base pair synthetic DNA template derived from bacteriophage T7 gene 10 plus 30 pmol of a 23 base primer complementary to the 3' end of the template strand. The reaction mixture was incubated at 95° C. for 3 minutes to denature the DNA strands, then incubated at 60° C. for 10 minutes with 1.5 pmol of the acridinium ester labeled detection probe. Unhybridized probe was hydrolysed at 60° C. for 7 minutes with an alkaline borate buffer and the remaining chemiluminescence, contributed by the hybridized labeled probe, was measured in a LEADER 1™ luminometer, (Gen-Probe Incorporated, San Diego, Calif.), after injection of a dilute solution of H2 O2 and a solution of sodium hydroxide.

Kết quả (Việt) 2:

Bst DNA Polymerase Hoạt động Xét nghiệm
hoạt động polymerase Bst DNA được xác định bằng một phản ứng tổng hợp cDNA sử dụng một mẫu duy nhất sợi tổng hợp và mồi bổ sung cho một phần của mẫu. Phát hiện của các sợi cDNA được thực hiện bằng cách lai tạo các sản phẩm polymerase với một đầu dò acridinium ester-dán nhãn thiết kế để bổ sung cho các sợi cDNA. Các nhãn kép lai được phát hiện bằng cách sử dụng thử nghiệm bảo vệ lai ​​(HPA) như được mô tả trong Arnold et al., Clin. Chem. 35: 1588-1594 (1989) và Arnold et al, Mỹ Pat.. Số 5.283.174, thì sau đó rất thích sở hữu chung với các ứng dụng hiện tại và cả trong số đó đều bãi kết hợp bằng cách tham chiếu trong tài liệu này. Mẫu nghi ngờ chứa Bst DNA polymerase được ủ trong một hỗn hợp phản ứng có chứa 50 mM Tris (pH 7.5), 25 mM KCl, 4 mM MgCl2, 2 mM spermidine, 0,2 mM mỗi dNTP ở 60 ° C. phút 8 với 20 fmol của 86 cặp base DNA tổng hợp mẫu có nguồn gốc từ gen bacteriophage T7 10 cộng với 30 pmol của mồi 23 cơ sở bổ sung vào đầu 3 'của mạch khuôn. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 95 ° C. 3 phút để làm biến tính các sợi DNA, sau đó ủ ở 60 ° C. 10 phút với 1,5 pmol của phát hiện dò acridinium ester dán nhãn. Thăm dò Unhybridized được thủy phân ở 60 ° C. phút 7 với một bộ đệm borate kiềm và Chemiluminescence còn lại, đóng góp của các đầu dò gắn nhãn lai, được đo ở LEADER 1 ™ luminometer, (Gen-Probe Incorporated, San Diego, Calif.) , sau khi tiêm một dung dịch loãng của H2 O2 và dung dịch natri hydroxit.