The NoV GI and GII primers and TaqM

The NoV GI and GII primers and TaqMan probe sets were originally described by Stals et al. (2009) QNIF4 (+) CGCTGGATGCGNTTCCAT; NV1LCR (−) CCTTAGACGCCATCATCATTTAC; and NVGG1p 6-FAMTGGACAGGAGAYCGCRATCT-BHQ-1, and were purchased from Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Reactions were performed using the OneStep RT-PCR Kit (Qiagen, Valencia, CA) in accordance with the manufacturer's recommended procedures in 25 μl reaction B.A. Dancho et al. / International Journal of Food Microbiology 155 (2012) 222–226 223mixtures with 5 U of RNase inhibitor (Invitrogen). Reverse transcription of all viral RNA was performed at 50 °C for 30 min followed by a 15-min Taq activation step at 95 °C followed by 50 amplification cycles using a 95 °C 15 s denaturation step and an annealing/extension step at 60 °C for 60 s. Primer and probe concentrations were as previously determined by Stals et al. (2009); GI: 500 nM of primer QNIF4, 900 nM of primer NV1LCR, 100 nM of probe NVGG1p. The GI and GII plasmids containing 100 and 102-bp GI and GII sequences, including the primer/probe binding sites, were used as positive control standards. Plasmid DNA was purified using the Plasmid Maxi Kit (Qiagen) and absorbance was quantified at 260 nm with a NanoDrop 2000 Spectrophotometer (Thermo Fisher, Wilmington, DE). Positive controls for the RT step were produced by extraction of viral RNA from the NoV using the ViralAmp RNA extraction kit (Qiagen), and negative controls containing all of the reagents except template were included with each set of reactions. Real-time PCR assays were performed in a Smart Cycler (Cepheid, Sunnyvale, CA). The fluorescence was measured during the annealing/extension step of each cycle. The cycle threshold (Ct) was defined as the cycle number at which the fluorescence of each sample crossed the threshold value of 30. Standard curves were generated from plotting the regression of duplicate 10-fold serial dilutions (109 genomic copies to one genomic copy) of the GI plasmid. The Ct values of the viral RNA were applied to the standard curves for quantitative readouts reported as copy number of pGI.1 or GII.4.

Kết quả (Việt) 1:

Tháng mười một GI và GII chất nền, mồi và TaqMan thăm dò bộ ban đầu được miêu tả bởi Stals et al. (2009) QNIF4 (+) CGCTGGATGCGNTTCCAT; NV1LCR (−) CCTTAGACGCCATCATCATTTAC; và NVGG1p 6-FAMTGGACAGGAGAYCGCRATCT-BHQ-1, và đã được mua từ tích hợp công nghệ DNA (Coralville, IA). Phản ứng đã được thực hiện bằng cách sử dụng một RT-PCR Kit (Qiagen, Valencia, CA) theo quy định thủ tục được đề nghị của nhà sản xuất trong 25 μl phản ứng ba Dancho et al. / International Journal của thực phẩm vi sinh vật học 155 (2012) 222-226 223mixtures với chất ức chế U RNase 5 (Invitrogen). Đảo ngược phiên mã của RNA virus tất cả được thực hiện tại 50 ° C trong 30 phút, theo sau là một 15-phút Taq kích hoạt bước ở 95 ° C theo sau 50 chu kỳ khuếch đại bằng cách sử dụng một 95 ° C 15 s denaturation bước và một bước làm cho deo/mở rộng ở 60 ° C cho 60 s. mồi và thăm dò nồng độ như trước đây đã được xác định bởi Stals et al. (2009); GI: 500 nM của mồi QNIF4, 900 nM của mồi NV1LCR, 100 nM thăm dò NVGG1p. Các GI và GII plasmid có 100 và 102-bp GI và GII chuỗi, bao gồm cả các mồi/thăm dò ràng buộc các trang web, được sử dụng như là tiêu chuẩn kiểm soát tích cực. Plasmid DNA được tinh chế bằng cách sử dụng bộ Maxi Plasmid (Qiagen) và hấp thu được định lượng tại 260 nm với một NanoDrop 2000 phối (Thermo Fisher, Wilmington, DE). Tích cực điều khiển cho bước RT được sản xuất bằng cách khai thác của virus ARN từ tháng mười một bằng cách sử dụng bộ công cụ khai thác ViralAmp RNA (Qiagen), và tiêu cực điều khiển có chứa tất cả các thuốc thử ngoại trừ mẫu được đính kèm với mỗi bộ phản ứng. Thời gian thực Đảng Cộng sản Romania thử nghiệm đã được thực hiện trong một người đạp xe máy thông minh (Cepheid, Sunnyvale, CA). Huỳnh quang đã được đo trong bước đầu làm cho deo/mở rộng của mỗi chu kỳ. Chu kỳ ngưỡng (Ct) được định nghĩa là số chu kỳ lúc đó huỳnh quang của mỗi mẫu vượt qua giá trị ngưỡng của 30. Tiêu chuẩn đường cong đã được tạo ra từ âm mưu hồi quy trùng lặp 10-fold nối tiếp dilutions (109 gen bản để một gen copy) của GI plasmid. Các giá trị Ct của RNA virus đã được áp dụng cho các đường cong tiêu chuẩn nhất định lượng kết báo cáo là bản sao số của pGI.1 hoặc GII.4.

Kết quả (Việt) 2:

Các GI Nov và mồi GII và bộ dò TaqMan ban đầu được mô tả bởi Stals et al. (2009) QNIF4 (+) CGCTGGATGCGNTTCCAT; NV1LCR (-) CCTTAGACGCCATCATCATTTAC; và NVGG1p 6-FAMTGGACAGGAGAYCGCRATCT-BHQ-1, và được mua từ hợp DNA Technologies (Coralville, IA). Phản ứng được thực hiện bằng cách sử dụng Kit OneStep RT-PCR (Qiagen, Valencia, CA) phù hợp với các thủ tục đề nghị của nhà sản xuất trong 25 ml phản ứng BA Dancho et al. / Tạp chí Quốc tế về Thực phẩm Vi sinh vật 155 (2012) 222-226 223mixtures với 5 U của RNase inhibitor (Invitrogen). Phiên mã ngược của tất cả các RNA của virus được thực hiện ở 50 ° C trong 30 phút tiếp theo là một bước kích hoạt 15 phút Taq tại 95 ° C sau 50 chu kỳ khuếch đại sử dụng một 95 ° C 15 s biến tính bước và một bước ủ / mở rộng tại 60 ° C trong 60 s. Nồng độ mồi và thăm dò như trước đây được xác định bởi Stals et al. (2009); GI: 500 nM lót QNIF4, 900 nM lót NV1LCR, 100 nM của tàu thăm dò NVGG1p. GI và GII plasmid chứa GI 100 và 102-bp và trình tự GII, bao gồm các lớp sơn lót / ràng buộc các trang web thăm dò, được sử dụng làm tiêu chuẩn kiểm soát tích cực. Plasmid DNA đã tinh khiết sử dụng Kit Plasmid Maxi (Qiagen) và hấp thụ được lượng ở 260 nm với một NanoDrop 2000 Spectrophotometer (Thermo Fisher, Wilmington, DE). Điều khiển tích cực cho bước RT đã được sản xuất bằng cách chiết RNA của virus từ các Nov bằng gói chiết RNA ViralAmp (Qiagen), và điều khiển âm có chứa tất cả các chất phản ứng ngoại trừ mẫu được bao gồm trong mỗi tập hợp phản ứng. Xét nghiệm PCR thời gian thực được thực hiện trong một Cycler Smart (Cepheid, Sunnyvale, CA). Huỳnh quang được đo trong bước ủ / extension của mỗi chu kỳ. Ngưỡng chu kỳ (Ct) được định nghĩa là số chu kỳ mà tại đó sự phát huỳnh quang của mỗi mẫu vượt giá trị ngưỡng 30. đường cong chuẩn được tạo ra từ âm mưu hồi quy các độ pha loãng tiếp 10 lần trùng lặp (109 bản sao gen được một bản sao gen) của plasmid GI. Các giá trị Ct của RNA virus đã được áp dụng cho các đường cong chuẩn cho readouts lượng báo cáo là số lượng bản sao của pGI.1 hoặc GII.4.