Effects of pH and temperature on am

Effects of pH and temperature on aminopeptidase activity.
The effect of pH on aminopeptidase activity was determined in the range from pH 3.5 to 8.5 by using the following buffers: 50 mM citric acid-NaOH, pH 3.5 to 5.5; 50 mM sodium acetate, pH 4.0 to 5.5; 50 mM sodium phosphate, pH 6.0 to 7.0; and Tris-HCl, pH 7.5 to 8.5. The effect of temperature was determined at the optimum pH in the range from 6 to 40°C, by adapting the incubation time to the stability of the enzyme at each temperature, as previously described (22). In every case, activity was expressed as a percentage of the activity obtained at either the optimum pH or the optimum temperature.

Effects of chemical agents and metal cations on aminopeptidase activity.The effects of potential inhibitors or activators on arginine aminopeptidase activity were determined by addition of several chemical agents and metal salts, at 0.1 or 1 mM, to the reaction buffer. Activity was assayed as described above and expressed as a percentage of the activity obtained in the absence of the added compound.

Substrate specificity.The relative activities of the arginine aminopeptidase against several fluorescent substrates were determined by the standard activity assay. The relative rates of hydrolysis of several aminoacyl-p-nitroanilide (pNA) substrates were also determined. The reaction mixture consisted of 250 μl of 50 mM citric acid-NaOH (pH 5.0) containing 0.5 mM substrate and 50 μl of enzyme. Absorbance at 415 nm was determined in a multiplate reader (Ultramark Model 550; Bio-Rad) after 30 min of incubation. Relative activities against various dipeptides were assayed by monitoring their disappearance by high-performance liquid chromatography (HPLC) using a 1050 Hewlett-Packard HPLC system (Waters Corporation, Milford, Mass.). The reaction mixture consisted of 100 μl of 50 mM citric acid-NaOH (pH 5.0), 25 μl of 10 mM peptide, and 25 μl of enzyme. The mixture was incubated at 37°C for as long as 60 min, and the reaction was stopped by addition of 25 μl of 30% acetic acid. Samples (20 μl) were loaded onto a Spherisorb SCX column (25 by 0.46 cm; Teknokroma, Barcelona, Spain). Separation was carried out by using a sodium chloride gradient between two solvents: 20% (vol/vol) acetonitrile in 6 mM HCl (solvent A) and 20% (vol/vol) acetonitrile in 6 mM HCl containing 1 M NaCl (solvent B). Peptides were eluted in a linear gradient from 0 to 55% solvent B for 8 min at a flow rate of 1.2 ml · min−1 at 40°C. Detection was carried out at 214 nm by using a variable-wavelength UV detector. All dipeptides, fluorogenic substrates, and chromogenic substrates were obtained from Sigma.

Determination of kinetic parameters.Kinetic parameters of the purified enzyme were estimated for Arg-AMC and Lys-AMC by using concentrations ranging from 0.005 to 0.1 mM. Activity was measured continuously at 37°C as described above. Kinetic parameters were calculated from Lineweaver-Burk plots.

Previous Section
Next Section
RESULTS

Purification of the enzyme.An arginine aminopeptidase of L. sakei was purified by selective fractionation with ammonium sulfate and three chromatographic steps. The results of each purification step are shown in Table 1 and Fig. 1. The Arg-AMC hydrolyzing activity eluted from the phenyl-Sepharose column as a unique peak at 0.16 to 0.14 M (NH4)2SO4. This activity partially coeluted with Leu-AMC hydrolyzing activity (Fig. 1A). The chromatographic step on the gel filtration column allowed the complete separation of the contaminant aminopeptidase activity (eluent volume, 84 ml) from the Arg-AMC hydrolyzing activity (eluent volume, 60 ml) (Fig. 1B). The Arg-AMC hydrolyzing activity eluted from the Resource Q column as two separate peaks: a minor fraction at 0.22 M NaCl and a major fraction at 0.29 M NaCl (Fig. 1C). The fractions corresponding to the second peak showed a unique protein band when analyzed by SDS-PAGE (Fig. 2). The whole procedure resulted in a recovery yield of 4.2% and a 500-fold increase in specificity.

FIG. 1.
View larger version:
In this page In a new window
Download as PowerPoint Slide
FIG. 1.
Chromatograms from different steps in the purification of L. sakei arginine aminopeptidase. Proteins were detected by measuring the absorbance at 280 nm (solid line); aminopeptidase activity was assayed against Arg-AMC, at pH 5.0 (solid circles), and Leu-AMC, at pH 7.5 (solid squares) (see Materials and Methods for details) and expressed in fluorescence units (FU). (A) Phenyl-Sepharose chromatography with (NH4)2SO4 gradient (light dotted line); (B) Sephacryl 200 HR chromatography; (C) Resource Q chromatography with NaCl gradient (light dotted line).

FIG. 2.
View larger version:
In this page In a new window
Download as PowerPoint Slide
FIG. 2.
Electrophoretic analysis (SDS-PAGE) of arginine aminopeptidase active fractions obtained in different purification steps. Lane 1, molecular weight markers (in thousands); lane 2, cell extract; lane 3, 50 to 70% ammonium sulfate cut; lane 4, phenyl-Sepharose chromatography; lane 5, Sephacryl 200 HR chromatography; lane 6, Resource Q chromatography.

View this table:
In this window In a new window
TABLE 1.
Purification of arginine aminopeptidase from L. sakei

Molecular mass.The molecular mass of the purified enzyme estimated by SDS-PAGE analysis was approximately 60 kDa (Fig. 2, lane 6). The relative molecular mass of the native enzyme estimated by gel filtration on a Sephacryl 200 HR column was around 180 kDa. These results suggested that the purified enzyme is a trimer.

Effects of pH and temperature.The purified enzyme showed activity in a narrow pH range (4.0 to 6.0), with an optimum at pH 5.0, in both 50 mM sodium acetate-acetic acid and 50 mM citric acid-NaOH (Fig. 3A). The activity was negligible at pH values beyond 4.0 and 6.0. The activity of the purified enzyme was optimal at 37°C but was sharply reduced at 40 to 45°C (Fig. 3A). The reduction in enzyme activity at high temperatures was not due to a decay in stability during the incubation time (5 min) (Fig. 3B). At low temperatures such as 6 to 15°C, the enzyme retained 20 to 30% of its optimal activity (Fig. 3A).

FIG. 3.
View larger version:
In this page In a new window
Download as PowerPoint Slide
FIG. 3.
(A) Effects of pH and temperature on arginine aminopeptidase activity from L. sakei using Arg-AMC as a substrate. Symbols: ▴, activities in 50 mM citric acid-NaOH at varying pHs; ○, activities in 50 mM sodium acetate-acetic acid at varying pHs; ▪, activities at varying temperatures. Activities at optimal pH and temperature were assigned a value of 100%. (B) Stability of arginine aminopeptidase at different temperatures: 30°C (•), 37°C (▪), 40°C (▴), and 45°C (▾). Initial activities were assigned a value of 100%.

Effects of chemical agents and metal cations.The effects observed in the presence of potential inhibitors or activators of the enzyme are shown in Tables 2 and 3. The sulfhydryl group reagent iodoacetate completely inhibited aminopeptidase activity, while reducing agents, particularly dithiothreitol, activated the enzyme. These results suggested that sulfhydryl groups are involved in the catalytic activity. However, the other cysteine protease inhibitor, trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido-(4-guanidino)butane (E-64), had no effect on the activity.

View this table:
In this window In a new window
TABLE 2.
Effects of chemical agents on the activity of purified arginine aminopeptidase

View this table:
In this window In a new window
TABLE 3.
Effects of metal cations on the activity of purified arginine aminopeptidase

The chelating agent EDTA had a stimulating effect (28 to 46%) on arginine aminopeptidase activity (Table 2). The serine protease inhibitors phenylmethylsulfonyl fluoride and 3,4-dichloroisocoumarin, the cysteine and serine protease inhibitor leupeptin, and typical inhibitors of exopeptidases, such as puromycin and bestatin, did not have any remarkable effect on the activity (Table 2).

The presence of Cu2+, Hg2+, and Zn2+ caused a complete inhibition at 1.0 mM, while less pronounced effects (10 to 30% inhibition) were observed in the presence of the remaining divalent cations (Table 3). The enzyme was activated by increasing concentrations of NaCl, with a maximum at 0.6 M (Fig. 4). The presence of high concentrations (0.5 to 3 M) of ammonium sulfate, used in the purification procedure, provoked 40 to 75% inhibition of the aminopeptidase activity (Fig. 4).

FIG. 4.
View larger version:
In this page In a new window
Download as PowerPoint Slide
FIG. 4.
Effects of NaCl (▪) and (NH4)2SO4 (•) on arginine aminopeptidase activity from L. sakei using Arg-AMC as a substrate. Activity in the absence of any salt was assigned a value of 100%.

Substrate specificity.The purified enzyme was active only against the AMC and pNA derivatives of basic amino acids (Table 4). The hydrolysis rates obtained with lysine-derived substrates were only about 4% of those obtained with arginine-derived substrates. The enzyme did not show endoproteinase activity, as it did not hydrolyze N-α-benzoyl-Arg-AMC (Table 4). Among all dipeptides tested, only those containing basic residues at the N-terminal position were hydrolyzed. The hydrolysis rates of peptides with the sequence Lys-X (where X stands for Ala or Lys) were approximately 30% of those of peptides with the sequence Arg-X. The nature of the amino acid residue at the C terminus of dipeptides also had an effect on hydrolysis rates. Activity was maximal toward peptides containing either Arg, Lys, or Ala as the C-terminal residue of Arg-X dipeptides, while the presence of Phe, Ile, Leu, or Asp at this position reduced the hydrolysis rates to values similar to those obtained with dipeptides containing lysine at the N terminus (Table 5).

View this table:
In this window In a new window
TABLE 4.
Relative activities of purified arginine aminopeptidase on various fluorescent (AMC-derived) and colorimetric (pNA-d

Kết quả (Việt) 1:

Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ trên aminopeptidase hoạt động.
tác động của pH aminopeptidase hoạt động đã được xác định trong phạm vi từ pH 3,5 để 8.5 bằng cách sử dụng bộ đệm sau: 50 mM axít citric-NaOH, độ pH 3,5 để 5.5; 50 mM natri axetat, pH 4,0 đến 5,5; 50 mM Dinatriyfosfat, pH 6.0 để 7.0; và Tris-HCl, pH 7.5 đến 8.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đã được xác định ở pH tối ưu trong khoảng từ 6 đến 40° C, bởi thích nghi thời gian ủ bệnh với sự ổn định của enzym ở nhiệt độ mỗi, như được mô tả trước đó (22). Trong mọi trường hợp, hoạt động được biểu thị dưới dạng một tỷ lệ phần trăm của hoạt động đạt được độ pH tối ưu hoặc nhiệt độ tối ưu.

Ảnh hưởng của lò và cation kim loại trên aminopeptidase hoạt động.Những ảnh hưởng của tiềm năng ức chế hoặc tính arginine aminopeptidase hoạt động đã được xác định bằng cách thêm một số lò và kim loại muối, tại 0,1 hoặc 1 mM, để các bộ đệm phản ứng. Hoạt động assayed như mô tả ở trên và diễn tả như một tỷ lệ phần trăm của hoạt động thu được trong sự vắng mặt của các hợp chất thêm.

đặc trưng bề mặt.Các hoạt động tương đối của arginine aminopeptidase chống lại một số chất huỳnh quang đã được xác định bởi tiêu chuẩn hoạt động khảo nghiệm. Các mức giá tương đối của thủy phân một số chuyển-p-nitroanilide (pNA) chất cũng được xác định. Hỗn hợp phản ứng bao gồm 250 μl 50 mM axít citric-NaOH (pH 5.0) có chứa chất nền 0,5 mM và 50 μl enzyme. Hấp thu tại 415 nm được xác định trong một người đọc multiplate (Ultramark mô hình 550; Bio-Rad) sau 30 phút của ủ bệnh. Các hoạt động tương đối với các dipeptides được assayed bằng cách giám sát của sự biến mất của hiệu suất cao chất lỏng sắc kí (HPLC) bằng cách sử dụng một hệ thống Hewlett-Packard HPLC 1050 (công ty cổ phần nước, Milford, Mass). Hỗn hợp phản ứng bao gồm 100 μl 50 mM axít citric-NaOH (pH 5.0), 25 μl 10 mM peptide, và 25 μl enzyme. Hỗn hợp được ủ tại 37° C cho tới chừng nào 60 phút, và phản ứng đã dừng lại bằng cách thêm 25 μl 30% axit axetic. Mẫu (20 μl) đã được tải lên một Spherisorb SCX cột (25 bởi 0,46 cm; Teknokroma, Barcelona, Tây Ban Nha). Tách được thực hiện bằng cách sử dụng một gradient natri clorua giữa hai dung môi: 20% (vol/vol) acetonitrile mm 6 HCl (dung môi A) và 20% (vol/vol) acetonitrile mm 6 HCl có 1 M NaCl (dung môi B). Peptide được eluted trong một gradient tuyến tính từ 0 đến 55% dung môi B cho 8 phút tại một tốc độ dòng chảy của cách 1.2 ml · Min−1 ở 40° C. Phát hiện được thực hiện tại 214 nm bằng cách sử dụng một máy dò tia UV bước sóng biến. Tất cả dipeptides, fluorogenic chất nền, và chromogenic chất nền được thu được từ Sigma.

xác định tham số động lực.Các tham số động của enzym tinh khiết được ước tính cho Arg-AMC và Lys-AMC bằng cách sử dụng nồng độ khác nhau, từ 0,005 0,1 mM. Hoạt động đã được đo liên tục ở 37° C như mô tả ở trên. Động lực tham số được tính từ Lineweaver-Burk lô.

trước phần
phần kế tiếp
kết quả

Thanh lọc của enzym.Một aminopeptidase arginine của L. sakei được tinh chế bằng chọn lọc phân với amoni sulfat và ba bước chromatographic. Kết quả của mỗi bước làm sạch được hiển thị trong bảng 1 và hình 1. Arg-AMC hoạt động hydrolyzing eluted từ cột phênyl-Sepharose như là một cao điểm độc đáo tại 0,16 để 0,14 M (NH4) 2SO4. Hoạt động này một phần coeluted với các hoạt động chế Leu-AMC (hình 1A). Chromatographic bước vào cột lọc gel cho phép tách chất gây ô nhiễm aminopeptidase hoạt động (khối lượng eluent, 84 ml), hoàn thành từ hoạt động hydrolyzing Arg-AMC (khối lượng eluent, 60 ml) (hình 1B). Arg-AMC hoạt động hydrolyzing eluted từ cột tài nguyên Q là hai đỉnh núi riêng biệt: một phần nhỏ tại 0,22 M NaCl và một phần lớn tại 0,29 M NaCl (hình 1 c). Các phân số tương ứng với đỉnh cao thứ hai cho thấy một ban nhạc độc đáo protein khi phân tích bởi dùng mũi SDS-trang (hình 2). Các thủ tục toàn bộ kết quả trong một năng suất phục hồi của 4,2% và tăng 500-fold trong một đặc trưng.

hình 1.
xem phiên bản lớn hơn:
trong trang này trong một cửa sổ mới
tải về là PowerPoint Slide
hình 1.
Chromatograms từ bước khác nhau trong thanh lọc L. sakei arginine aminopeptidase. Protein được phát hiện bằng cách đo hấp thu tại 280 nm (rắn dòng); hoạt động aminopeptidase được assayed Arg-AMC, ở pH 5.0 (rắn vòng tròn) và Leu-AMC, ở pH 7,5 (rắn hình vuông) (xem tài liệu và phương pháp để biết chi tiết) và thể hiện trong các đơn vị sự phát huỳnh quang (FU). (A) phênyl-Sepharose sắc kí với (NH4) 2SO4 gradient (ánh sáng đường chấm chấm); (B) sắc kí Sephacryl 200 nhân sự; (C) tài nguyên Q sắc kí với NaCl gradient (ánh sáng đường chấm chấm).

hình 2.
xem phiên bản lớn hơn:
trong trang này trong một cửa sổ mới
tải về là PowerPoint Slide
hình 2.
Electrophoretic phân tích (dùng mũi SDS-trang) của arginine aminopeptidase hoạt động được trong các bước khác nhau làm sạch phân số. Lane 1, trọng lượng phân tử đánh dấu (trong hàng ngàn); Lane 2, trích xuất tế bào; Lane 3, 50-70% amoni sulfat cắt; Lane 4, sắc ký phênyl-Sepharose; Lane 5, sắc kí Sephacryl 200 nhân sự; Lane 6, tài nguyên Q sắc kí.

xem bảng này:
trong cửa sổ này trong một cửa sổ mới
Bảng 1.
thanh lọc của arginine aminopeptidase từ L. sakei

khối lượng phân tử.Khối lượng phân tử của enzym tinh khiết ước tính bằng cách dùng mũi SDS-trang phân tích là khoảng 60 kDa (hình 2, lane 6). Khối lượng phân tử tương đối của enzym bản xứ ước tính của gel lọc vào một cột Sephacryl 200 HR là khoảng 180 kDa. Những kết quả này gợi ý rằng enzym tinh khiết là một trimer.

Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ.Enzym tinh khiết cho thấy các hoạt động trong một phạm vi hẹp pH (4,0 đến 6.0), với một tối ưu ở pH 5.0, ở cả 50 mM natri axetat acetic acid và 50 mM axít citric-NaOH (hình 3A). Các hoạt động là không đáng kể tại pH giá trị vượt ra ngoài 4.0 và 6.0. Các hoạt động của enzym tinh khiết là tối ưu ở 37° C nhưng mạnh giảm 40-45° c (hình 3A). Việc giảm hoạt động của enzyme ở nhiệt độ cao đã không do một phân rã sự ổn định trong thời gian ủ bệnh (5 phút) (hình 3B). Ở nhiệt độ thấp như 6 đến 15 ° C, enzyme giữ lại 20-30% của hoạt động tối ưu của nó (hình 3A).

hình 3.
xem phiên bản lớn hơn:
trong trang này trong một cửa sổ mới
tải về là PowerPoint Slide
hình 3.
(A) ảnh hưởng của pH và nhiệt độ trên arginine aminopeptidase hoạt động từ L. sakei sử dụng Arg-AMC như bề mặt một. Biểu tượng: ▴, hoạt động trong 50 mM axít citric-NaOH tại pHs khác nhau; ○, hoạt động trong 50 mM natri axit axetic axetat tại pHs khác nhau; ▪ hoạt động ở nhiệt độ khác nhau. Các hoạt động tại pH tối ưu và nhiệt độ được gán một giá trị của 100%. (B) ổn định của arginine aminopeptidase ở nhiệt độ khác nhau: 30° C (•), 37° C (▪), 40° C (▴), và 45° C (▾). Các hoạt động ban đầu được gán một giá trị của 100%.

Effects của lò và cation kim loại.Những tác động quan sát thấy sự hiện diện của tiềm năng ức chế hoặc tính của enzyme được hiển thị trong bảng 2 và 3. Sulfhydryl nhóm tinh khiết iodoacetate hoàn toàn ức chế hoạt động aminopeptidase, trong khi đại lý giảm, đặc biệt là dithiothreitol, kích hoạt enzym. Những kết quả này gợi ý rằng sulfhydryl nhóm được tham gia vào các hoạt động xúc tác. Tuy nhiên, khác cysteine protease chất ức chế, trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido-(4-guanidino)butane (E-64), không có tác dụng trên các hoạt động.

Xem bảng này:
trong cửa sổ này trong một cửa sổ mới
bảng 2.
ảnh hưởng của lò trên các hoạt động của tinh khiết arginine aminopeptidase

xem bảng này:
trong cửa sổ này trong một cửa sổ mới
bảng 3.
hiệu ứng kim loại cation về hoạt động của tinh khiết arginine aminopeptidase

chelating đại lý EDTA có một tác dụng kích thích (28-46%) trên arginine aminopeptidase hoạt động (bảng 2). Serine protease ức chế phenylmethylsulfonyl florua và 3,4-dichloroisocoumarin, cystein và serine protease chất ức chế leupeptin và ức chế điển hình của exopeptidases, chẳng hạn như puromycin và bestatin, không có bất kỳ tác động đáng kể về hoạt động (bảng 2).

sự hiện diện của Cu2, Hg2, và Zn2 gây ra một sự ức chế hoàn chỉnh tại 1.0 mM, trong khi ít phát âm hiệu ứng (10-30% ức chế) đã được quan sát thấy sự hiện diện của cation tương còn lại (bảng 3). Enzym đã được kích hoạt bằng cách tăng nồng độ của NaCl, với tối đa tại 0,6 M (hình 4). Sự hiện diện của nồng độ cao (0,5 đến 3 M) của amoni sulfat, được sử dụng trong quy trình lọc, kích động 40-75% sự ức chế hoạt động aminopeptidase (hình. 4).

hình 4.
xem phiên bản lớn hơn:
trong trang này trong một cửa sổ mới
tải về là PowerPoint Slide
hình 4.
hiệu ứng NaCl (▪) và 2SO4 (NH4) (•) trên arginine aminopeptidase hoạt động từ L. sakei sử dụng Arg-AMC như bề mặt một. Các hoạt động trong sự vắng mặt của bất kỳ muối được gán một giá trị của 100%.

Substrate đặc trưng.Enzym tinh khiết được hoạt động chỉ chống lại các dẫn xuất AMC và pNA của axit amin cơ bản (bảng 4). Tỷ lệ thủy phân thu được với chất có nguồn gốc lysine là chỉ khoảng 4% của những người thu được với arginine bắt nguồn chất nền. Enzyme không cho thấy hoạt động endoproteinase, như nó đã không hydrolyze N-α-benzoyl-Arg-AMC (bảng 4). Trong số tất cả dipeptides thử nghiệm, chỉ những người có các dư lượng cơ bản tại vị trí N-ga đã được thủy phân đạm. Tỷ lệ thủy phân của peptide với chuỗi Lys-X (mà X là viết tắt của Ala hoặc Lys) đã là khoảng 30% của những người của peptide với chuỗi Arg-X. Bản chất của các dư lượng axit amin tại terminus C của dipeptides cũng có ảnh hưởng đến tỷ lệ thủy phân. Hoạt động được tối đa về hướng peptide có Arg, Lys hoặc Ala như dư lượng C thiết bị đầu cuối của Arg-X dipeptides, trong khi sự hiện diện của Phe, Ile, Leu, hoặc Asp vào vị trí này giảm tỷ lệ thủy phân để giá trị tương tự như thu được với dipeptides có chứa lysine tại terminus N (5 bàn).

xem bảng này:
trong cửa sổ này trong một cửa sổ mới
bảng 4.
Các hoạt động tương đối của tinh khiết arginine aminopeptidase ngày khác nhau huỳnh quang (AMC-nguồn gốc) và colorimetric (pNA-d