CALR mutations were detected in app

CALR mutations were detected in approximately 20% to 25% of patients with ET and PMF and not in patients with PV. Most CALR mutations were deletions and insertions in exon 9, which cause frameshift mutations. The type 1 (L367fs*46) mutation, which results from a 52–base pair (bp) deletion, is found in approximately 50% of patients with CALR mutations, and the type 2 (K385fs*47) mutation, which results from a 5-bp TTGTC insertion, accounts for approximately 30% of patients with CALR mutations.5-9 In patients with ET, CALR mutations have been associated with a lower hemoglobin level, lower leukocyte count, higher platelet count, and relatively low thrombotic risk.9-11 In this study, we investigated the mutation profiles of CALR, JAK2, and MPL mutations in four different MPN subtypes in Korean patients with PMF, ET, PV, and MPN-U. In addition, we investigated the mutation profile of patients with acute panmyelosis with myelofibrosis (APMF), which is a very rare acute myeloid leukemia (AML) subtype characterized by diffuse myelofibrosis and increased blasts of 20% or more. The BM histologic features of APMF are sometimes indistinguishable from the acute MPN phase, thus blurring a common distinction. We performed a correlation analysis of mutation patterns with clinical, hematologic, and cytogenetic characteristics and prognostic impacts.
Materials and Methods
Patients A series of 199 patients who were diagnosed with MPN and treated at Seoul National University Hospital were included in this study. The inclusion criteria for this study were the availability of BM samples collected at the time of diagnosis or revisit coupled with symptom aggregation after a follow-up period. MPNs were strictly diagnosed according to the 2008 WHO classification criteria.1 Patients were diagnosed with the following subtypes: 54 PMF, 79 ET, 58 PV, and eight MPN-U. Eight patients with MPN-U had panmyelosis without diffuse fibrosis; therefore, the prefibrotic stage of PMF, ET, or PV could not be determined. In addition, four patients with APMF who had blast increase and diffuse fibrosis were included in this study. The following laboratory and clinical information was obtained for each patient: dates of diagnosis and therapy initiation, age, sex, ethnicity, hemoglobin levels, platelet count, conventional G-banding cytogenetic analyses of BM cells, and the presence of splenomegaly. For patients with PMF, the Dynamic International Prognostic Scoring System–plus (DIPSS-plus) risk categorizations were assessed as previously described.12 This study complied with Declaration of Helsinki. All BM samples were collected with informed consent, and the study
was reviewed and approved by the Institutional Review Board of Seoul National University College of Medicine.
BM Histologic Examination Hematopathologists (S.Y.K. and D.S.L.) reviewed Wright-Giemsa–stained BM smears and H&E-stained sections of the BM trephine biopsy specimens. In all patients, immunohistochemical staining was performed for reticulin, collagen, CD34, CD117, and CD61 using BM sections (all from Dako, Glostrup, Denmark). BM fibrosis (MF) was assessed according to the European consensus grading system on a scale of MF-0 to MF-3.13
Cytogenetic Analysis Cytogenetic studies using standard G-banding techniques on heparinized BM samples were performed as part of the diagnostic workup. At least 20 metaphases were analyzed whenever possible. Clonal abnormalities were defined as two or more cells with the same chromosomal gain or structural rearrangement or at least three cells with the same chromosome deletion. Karyotypes were recorded according to the International System for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN) 2013.14 In addition, fluorescence in situ hybridization (FISH) was performed in most cases (n = 158). The following commercial FISH probes were used in subset of patients: a BCR/ ABL dual-color, dual-translocation probe (n = 158); the 13q14 SpectrumOrange probe (n = 66); the LSI D20S108 (20q12) probe (n = 77); the LSI EGR1 (5q31) probe (n = 27); the LSI D7S522 (7q31) probe (n = 18); the CEP 8 probe (n = 23); and the LSI 1p32/1q25 probe (n = 21) (all from Abbott Molecular, Des Plaines, IL). Slides were stained with FISH probes and counterstained with DAPI, and the fluorescence signals were analyzed by fluorescent microscopy (Zeiss, Göttingen, Germany). FISH results were recorded according to the ISCN 2013.14
DNA Extraction and Detection of Mutations Using Sanger Sequencing Genomic DNA was extracted from frozen BM mononuclear cells of all patients. DNA was extracted using the MagNA Pure LC DNA Isolation Kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) according to the manufacturer’s instructions. DNA quality was analyzed by assessing the 260/280 absorbance ratio using an ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). The following primers were used for polymerase chain reaction (PCR) amplification of the CALR, JAK2, and MPL genes: CALR forward, 5′-CAT TCA TCC TCC AGG TCA AG-3′; CALR reverse, 5′-AGG GGA ACA AAA CCA AAA TC-3′; JAK2 exon 14 forward, 5′-TCC TCA GAA CGT TGA TGG CA-3′; JAK2 exon 14 reverse, 5′-ATT GCT

Kết quả (Việt) 1:

CALR đột biến đã được phát hiện trong khoảng 20% đến 25% bệnh nhân với ET và PMF và không phải ở những bệnh nhân với PV. Hầu hết CALR đột biến đã là xóa và thêm vào trong exon 9, gây đột biến frameshift. Loại 1 (L367fs * 46) đột biến, mà kết quả từ một xóa 52-căn cứ cặp (bp), được tìm thấy trong khoảng 50% bệnh nhân bị đột biến CALR, và loại 2 (K385fs * 47) đột biến, mà kết quả từ một chèn TTGTC 5-bp, chiếm khoảng 30% bệnh nhân với CALR mutations.5-9 ở những bệnh nhân với ET, CALR đột biến đã được liên kết với một mức độ thấp của hemoglobin , số lượng bạch cầu thấp, cao tiểu cầu đếm, và tương đối thấp nơi risk.9-11 trong nghiên cứu này, chúng tôi điều tra các cấu hình đột biến CALR, JAK2 và MPL đột biến trong bốn phân nhóm MPN khác nhau ở Hàn Quốc bệnh nhân PMF, ET, PV và MPN-U. Ngoài ra, chúng tôi điều tra hồ sơ đột biến của bệnh nhân với panmyelosis cấp tính với myelofibrosis (APMF), là một phiên bản rất hiếm bạch cầu dòng tủy cấp tính (AML) đặc trưng bởi myelofibrosis khuếch tán và các vụ nổ tăng 20% hoặc hơn. Các tính năng mô học BM của APMF là đôi khi không thể phân biệt từ giai đoạn MPN cấp tính, do đó làm mờ một sự phân biệt phổ biến. Chúng tôi thực hiện một phân tích mối tương quan của đột biến mô hình với các đặc điểm lâm sàng, máu, và cytogenetic, prognostic tác động.Vật liệu và phương phápBệnh nhân A loạt 199 bệnh nhân được chẩn đoán với MPN và điều trị tại bệnh viện đại học quốc gia Seoul được áp dụng trong nghiên cứu này. Các tiêu chuẩn bao gồm cho nghiên cứu này là sự sẵn có của BM mẫu thu thập tại thời điểm chẩn đoán hoặc thăm lại cùng với triệu chứng tập hợp sau một thời gian theo dõi. MPNs đã được chẩn đoán nghiêm chỉnh theo các 2008 WHO phân loại criteria.1 bệnh nhân được chẩn đoán với phân nhóm sau: 54 PMF, 79 ET, 58 PV, và tám MPN-U. Các bệnh nhân tám với MPN-U có panmyelosis mà không khuếch tán xơ; Vì vậy, giai đoạn prefibrotic của PMF, ET hoặc PV có thể không được xác định. Ngoài ra, bốn bệnh nhân với APMF người có vụ nổ tăng và xơ hóa khuếch tán được áp dụng trong nghiên cứu này. Phòng thí nghiệm sau và lâm sàng thông tin được thu được cho mỗi bệnh nhân: ngày bắt đầu chẩn đoán và điều trị, tuổi, giới tính, dân tộc, hemoglobin cấp, tính tiểu cầu, thông thường G-dải cytogenetic phân tích của các tế bào BM, và sự hiện diện của splenomegaly. Cho bệnh nhân với PMF, phân loại hệ thống-plus (DIPSS-plus) nguy cơ động quốc tế Prognostic ghi được đánh giá như trước đây described.12 nghiên cứu này tuân thủ với tuyên bố của Helsinki. Tất cả BM mẫu đã được thu thập với thông báo chấp thuận, và nghiên cứu được xem xét và được chấp thuận bởi các thể chế đánh giá ban của Seoul National University College of Medicine.BM mô học kiểm tra Hematopathologists (S.Y.K. và D.S.L.) nhận xét Wright-Giemsa-màu BM smears và H & E-stained phần của BM trephine mẫu vật sinh thiết. Trong tất cả các bệnh nhân, immunohistochemical nhuộm được thực hiện cho reticulin, collagen, CD34, CD117, và CD61 sử dụng BM phần (Tất cả từ Dako, Glostrup, Đan Mạch). BM xơ (MF) được đánh giá theo sự đồng thuận châu Âu chấm điểm hệ thống trên quy mô của MF-0 để MF-3.13Cytogenetic nghiên cứu phân tích Cytogenetic bằng cách sử dụng tiêu chuẩn kỹ thuật dải G trên heparinized BM mẫu đã được thực hiện như một phần của workup chẩn đoán. Ít nhất 20 metaphases được phân tích bất cứ khi nào có thể. Vô tính bất thường được định nghĩa là hai hoặc nhiều tế bào với việc đạt được cùng một nhiễm sắc thể hoặc sắp xếp lại cấu trúc hoặc các tế bào ít nhất ba với cùng một nhiễm sắc thể xóa. Karyotypes đã được ghi lại theo hệ thống quốc tế cho con người Cytogenetic danh pháp (ISCN) 2013.14 ngoài ra, huỳnh quang trong situ lai ghép (cá) đã được thực hiện trong nhiều trường hợp (n = 158). Đầu dò cá thương mại sau đây được sử dụng trong tập hợp con của bệnh nhân: một BCR / ABL kép-màu sắc, dual-translocation thăm dò (n = 158); thăm dò SpectrumOrange 13q14 (n = 66); LSI D20S108 thăm dò (20q12) (n = 77); LSI EGR1 thăm dò (5q31) (n = 27); LSI D7S522 thăm dò (7q31) (n = 18); thăm dò CEP 8 (n = 23); và LSI 1 p 32/1q25 thăm dò (n = 21) (Tất cả từ phân Abbott tử, Des Plaines, IL). Slide màu với đầu dò cá và counterstained với DAPI, và các tín hiệu huỳnh quang được phân tích bằng kính hiển vi huỳnh quang (Zeiss, Göttingen, Đức). Kết quả cá đã được ghi lại theo ISCN 2013.14DNA khai thác và phát hiện của đột biến bằng cách sử dụng Sanger xác định trình tự gen DNA được chiết xuất từ tế bào BM mononuclear đông lạnh của tất cả bệnh nhân. DNA được chiết xuất bằng cách sử dụng các MagNA tinh khiết LC DNA cô lập Kit (Roche áp dụng khoa học, Indianapolis, IN) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Chất lượng ADN phân tích bằng cách đánh giá tỷ lệ hấp thu 260/280 bằng cách sử dụng một phối ND-1000 (NanoDrop công nghệ, Wilmington, DE). Lớp lót sau đây đã được sử dụng cho polymerase phản ứng dây chuyền (PCR) khuếch đại của các gen CALR, JAK2 và MPL: CALR về phía trước, 5 '-CAT TCA TCC TCC AGG TCA AG-3 '; Đảo ngược CALR, 5 '-AGG GGA ACA AAA CCA AAA TC-3 '; JAK2 exon 14 về phía trước, 5 '-TCC TCA GAA CGT TGA TGG CA-3 '; JAK2 exon 14 đảo ngược, 5 '-ATT GCT

Kết quả (Việt) 2:

Đột biến CALR đã được phát hiện trong khoảng 20% đến 25% bệnh nhân với ET và PMF và không ở những bệnh nhân với PV. Hầu hết các đột biến CALR đã xóa và chèn trong exon 9, gây đột biến khung đọc. The (L367fs * 46) đột biến loại 1, đó là kết quả của một cặp 52-base (bp) xóa bỏ, được tìm thấy ở khoảng 50% bệnh nhân có đột biến CALR, và loại 2 (K385fs * 47) đột biến, mà kết quả từ một chèn TTGTC 5-bp, chiếm khoảng 30% bệnh nhân với CALR mutations.5-9 Ở bệnh nhân ET, đột biến CALR đã được liên kết với một mức độ thấp hơn hemoglobin, số lượng bạch cầu thấp, số lượng tiểu cầu cao hơn, và nguy cơ huyết khối tương đối thấp. 9-11 Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu các cấu đột biến của đột biến CALR, JAK2, và MPL trong bốn phân nhóm MPN khác nhau ở những bệnh nhân Hàn Quốc với PMF, ET, PV, và MPN-U. Ngoài ra, chúng tôi nghiên cứu hồ sơ cá nhân đột biến của bệnh nhân với panmyelosis cấp tính với myelofibrosis (APMF), mà là một bệnh bạch cầu dòng tủy (AML) kiểu phụ cấp tính rất hiếm đặc trưng của khuếch tán myelofibrosis và tăng vụ nổ của 20% hoặc nhiều hơn. BM tính năng mô học của APMF đôi khi không thể phân biệt từ giai đoạn MPN cấp tính, do đó làm mờ một sự phân biệt phổ biến. Chúng tôi đã phân tích mối tương quan của mô hình đột biến với lâm sàng, huyết học, và các đặc tính di truyền tế bào và tác động tiên lượng.
Vật liệu và phương pháp
Bệnh nhân Một loạt 199 bệnh nhân được chẩn đoán và điều trị MPN tại Bệnh viện Đại học Quốc gia Seoul được đưa vào nghiên cứu này. Các tiêu chuẩn thu cho nghiên cứu này là sự sẵn có của mẫu BM lấy tại thời điểm chẩn đoán hoặc xem lại kết hợp với triệu chứng tập hợp sau một thời gian theo dõi. MPNs được chẩn đoán theo đúng 2008 WHO phân loại criteria.1 Bệnh nhân được chẩn đoán với các phân nhóm sau: 54 PMF, 79 ET, 58 PV, và tám MPN-U. Tám bệnh nhân với MPN-U có panmyelosis mà không có xơ hóa lan tỏa; Do đó, giai đoạn prefibrotic của PMF, ET, hoặc PV có thể không được xác định. Ngoài ra, bốn bệnh nhân APMF người đã tăng nổ và xơ hóa lan tỏa đã được đưa vào nghiên cứu này. Các phòng thí nghiệm và thông tin lâm sàng sau được lấy cho mỗi bệnh nhân: ngày chẩn đoán và điều trị khởi đầu, tuổi tác, giới tính, dân tộc, trình độ hemoglobin, số lượng tiểu cầu, thông thường G-dải phân tích di truyền tế bào của các tế bào BM, và sự hiện diện của lách to. Đối với bệnh nhân PMF, các Phân Loại nguy cơ động quốc tế tiên lượng Scoring System-cộng (DIPSS-plus) được đánh giá như trước đây described.12 Nghiên cứu này tuân thủ Tuyên bố Helsinki. Tất cả các mẫu BM đã được thu thập với sự chấp thuận, và nghiên cứu này
đã được xem xét và chấp thuận bởi Ủy Ban Duyệt Xét chế của Seoul National University College of Medicine.
BM mô học thi Hematopathologists (SYK và DSL) đã xem xét Wright-Giemsa nhuốm BM vết bẩn và H & E-nhuộm màu phần của các mẫu sinh thiết mổ sọ BM. Trong tất cả các bệnh nhân, nhuộm hóa mô miễn dịch đã được thực hiện cho reticulin, collagen, CD34, CD117, và CD61 sử dụng phần BM (tất cả từ Dako, Glostrup, Đan Mạch). BM xơ (MF) được đánh giá theo hệ thống đồng thuận chấm điểm châu Âu trên thang điểm từ 0 đến MF-MF-3.13
nghiên cứu di truyền tế bào phân tích tế bào bằng cách sử dụng các kỹ thuật G-dải tiêu chuẩn trên các mẫu BM heparin đã được thực hiện như một phần của workup chẩn đoán. Ít nhất 20 metaphases được phân tích bất cứ khi nào có thể. Bất thường về dòng vô tính đã được định nghĩa là hai hoặc nhiều hơn các tế bào với việc đạt được cùng một nhiễm sắc thể hoặc sắp xếp lại cấu trúc hoặc ít nhất ba loại tế bào với việc xóa NST. Karyotypes được ghi nhận theo hệ thống quốc tế về nhân di truyền tế bào Danh mục (iSCN) 2013,14 Ngoài ra, huỳnh quang lai tại chỗ (FISH) được thực hiện ở hầu hết các trường hợp (n = 158). Các đầu dò FISH thương mại sau đây đã được sử dụng trong tập hợp con của bệnh nhân: một BCR / ABL dual-màu sắc, đôi-chuyển vị thăm dò (n = 158); thăm dò 13q14 SpectrumOrange (n = 66); các D20S108 LSI (20q12) thăm dò (n = 77); LSI EGR1 (5q31) thăm dò (n = 27); LSI D7S522 (7q31) thăm dò (n = 18); CEP 8 đầu dò (n = 23); và LSI 1p32 / 1q25 thăm dò (n = 21) (tất cả từ Abbott Molecular, Des Plaines, IL). Slides đã được nhuộm màu với đầu dò FISH và counterstained với DAPI, và các tín hiệu huỳnh quang được phân tích bằng kính hiển vi huỳnh quang (Zeiss, Göttingen, Đức). Kết quả FISH đã được ghi nhận theo iSCN 2013,14
DNA chiết xuất và phát hiện các đột biến Sử dụng Sanger Sequencing ADN hệ gen được chiết xuất từ đông lạnh tế bào đơn nhân BM của tất cả các bệnh nhân. DNA được chiết xuất bằng cách sử dụng Magna DNA LC tinh khiết Isolation Kit (Roche Khoa học ứng dụng, Indianapolis, IN) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Chất lượng DNA được phân tích bằng cách đánh giá tỷ lệ 260/280 hấp thụ sử dụng một quang phổ NĐ-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). Các mồi sau đây đã được sử dụng cho phản ứng chuỗi polymerase (PCR) khuếch đại của gen CALR, JAK2, và MPL: CALR về phía trước, 5'-CAT TCA TCC TCC AGG TCA AG-3 '; CALR đảo ngược, 5'-AGG GGA ACA AAA CCA AAA TC-3 '; JAK2 exon 14 về phía trước, 5'-TCC TCA GAA CGT TGA TGG CA-3 '; JAK2 exon 14 đảo ngược, 5'-ATT GCT