Proteases are the most important cl

Proteases are the most important class of enzymes, which occupy a pivotal position with respect to their applications in both physiological and commercial fields. They account for more than 65% of the total industrial enzyme market (Banik and Prakash, 2004). Alkaline proteases are robust enzymes which have large variety of industrial applications, mainly in the detergent, food, pharmaceutical, silk and leather industries (Rao et al., 1998). Three entirely different areas of application of the alkaline protease from Vibrio sp. (V26) which include; the use in animal cell culture, in bioprocessing of used X-ray films and as an ingredient in detergents have been studied. The properties of the enzyme required for its application in peptide synthesis and food processing too have been investigated.


Chapter 5 Applications of alkaline protease from Vibrio sp. (V26)


5.1 Application of alkaline protease from Vibrio sp. (V26) in animal cell culture

One of the fields where proteases find application is in animal cell culture. The use of trypsin to detach growing cells from plasma clots was first introduced by Rous and Jones in 1916, a method that preceded the use of proteolytic enzymes for preparing separated cells from tissue fragments for primary culture. Trypsin has since remained a popular agent for primary dissociation of tissues for detaching cells from monolayers for subsequent passaging. The use of enzymes such as pancreatin, elastase (Rinaldini, 1958) and accutase (Bajpai et al., 2008) in tissue culture has also been investigated. As the above are of animal origin, their sources are restricted and they turn out to be expensive as well. Trypsin’s use is often limited by its narrow range of pH for action. Meanwhile ‘Pronase’ (Foley and Aftonomos, 1970), Collagenase (Hilfer, 1973), and Dispase (Kitano and Okada, 1983) are the microbial proteases that have found application in cell culture. Each of these enzymes has their own limitations as collagenase acts only on tissues containing collagen, while pronase with regard to its completeness of dispersion of certain continuous epithelial cell lines is inferior to trypsin (Foley and Aftonomos, 1970).

In the past 20 years or so, there have been a very few investigations on the application of proteases from microbes in animal cell culture (Chiplonkar et al., 1985; Nestler et al., 2004; Shankar et al., 2011) and they have all been from fungal origin.

So far, there have been no reports on the use of proteases from Vibrio species in this field. Moreover, as the alkaline protease from Vibrio sp. (V26) exhibited ‘detachase’ property during characterization studies; its application in the dissociation of cells from monolayer cell cultures and tissues of primary cell culture were investigated. The cell dissociating properties of protease from




Department of Marine Biology, Microbiology and Biochemistry 163


Chapter 5 Applications of alkaline protease from Vibrio sp. (V26)


Vibrio sp. (V26) was also compared to trypsin, an enzyme widely employed in animal cell culture.

5.1.1 Materials and Methods

5.1.1.1 Assay of protease

As the application is in animal cell culture; the activity assay was performed at pH 7.2 and 37oC as they were the conditions optimal for the cell lines. For the assay of the enzyme 500 µl suitably diluted enzyme was added to 500 µl casein (1%) prepared in PBS (phosphate buffered saline) (pH 7.2 ± 0.2) and incubated at 37oC for 30 minutes. The rest of the procedure is as mentioned in section 3.2.2.1.

5.1.1.2 Production of enzyme

Alkaline protease was produced by growing Vibrio sp. (V26) in modified Nutrient broth (Table 4.7) under optimized conditions.

5.1.1.3 Cell Lines and tissues used

HEp-2 (Human larynx epithelial cells), HeLa (Henritta Lacks, human cervical carcinoma) and RTG-2 (gonadial cell line derived from Oncorhynchus mykiss) cell lines were used in the investigation. Cell lines were maintained in Eagle’s MEM medium along with 2 mM glutamine, 1.5 g/L sodium bicarbonate and 10% FBS. HEp-2 and HeLa cells were maintained at 37oC while RTG-2 cells were grown at 25oC. Nine day old chick embryo was used for the development of chick embryo fibroblastic primary cell culture. The methods followed for the application of the enzyme in cell cultures and their maintenance was as per the standard protocols described by Freshney (2000).

5.1.1.4 Enzymes for cell culture study

Alkaline protease from Vibrio sp. (V26) (APV26): The cell free supernatant was precipitated with ammonium sulphate (40-80%) and the precipitate dissolved in minimum amounts of Tris-Cl buffer (pH 8.5). This was



Department of Marine Biology, Microbiology and Biochemistry 164


Chapter 5 Applications of alkaline protease from Vibrio sp. (V26)


then diafiltered and concentrated using Amicon UF stirred cell (Model 8010) with 10 kDa cut off membrane against Tris-Cl buffer (pH 8.5). The concentrated enzyme was lyoph

Kết quả (Việt) 2:

Protease là những lớp học quan trọng nhất của các enzyme, trong đó chiếm một vị trí quan trọng đối với các ứng dụng của họ trong cả hai lĩnh vực sinh lý học và thương mại. Họ chiếm hơn 65% tổng thị trường enzyme công nghiệp (Banik và Prakash, 2004). Protease kiềm là các enzym mạnh mẽ mà có lượng lớn các ứng dụng công nghiệp, chủ yếu là trong các ngành công nghiệp chất tẩy rửa, thực phẩm, dược phẩm, lụa và da (Rao et al., 1998). Ba khu vực hoàn toàn khác nhau của ứng dụng của protease kiềm từ vi khuẩn Vibrio sp. (V26) trong đó bao gồm; việc sử dụng trong nuôi cấy tế bào động vật, trong bioprocessing phim X-ray được sử dụng và là một thành phần trong chất tẩy rửa đã được nghiên cứu. Các thuộc tính của các enzyme cần thiết cho ứng dụng của nó trong tổng hợp peptide và chế biến thực phẩm cũng đã được nghiên cứu. Chương 5 ứng dụng của protease kiềm từ vi khuẩn Vibrio sp. (V26) 5.1 Ứng dụng của protease kiềm từ vi khuẩn Vibrio sp. (V26) trong nuôi cấy tế bào động vật Một trong những lĩnh vực mà các protease tìm thấy ứng dụng trong nuôi cấy tế bào động vật. Việc sử dụng của trypsin để tách tế bào ngày càng tăng từ các cục máu đông trong huyết tương lần đầu tiên được giới thiệu bởi Rous và Jones vào năm 1916, một phương pháp mà trước việc sử dụng các enzyme phân giải protein để chuẩn bị cho các tế bào tách ra từ các mảnh mô cho nền văn hóa chính. Trypsin có kể từ khi vẫn còn là một tác nhân phổ biến cho phân ly chính của mô cho tách tế bào từ lớp đơn cho passaging tiếp theo. Việc sử dụng các enzyme như pancreatin, elastase (Rinaldini, 1958) và accutase (Bajpai et al., 2008) trong nuôi cấy mô cũng đã được điều tra. Như ở trên có nguồn gốc động vật, các nguồn tin của họ bị hạn chế và họ lần lượt ra là đắt tiền là tốt. Sử dụng trypsin của thường bị giới hạn bởi phạm vi hẹp của pH cho hành động. Trong khi đó 'Pronase' (Foley và Aftonomos, 1970), collagenase (Hilfer, 1973), và Dispase (Kitano và Okada, 1983) là các protease vi sinh vật đã được ứng dụng trong nuôi cấy tế bào. Mỗi của các enzym này có những hạn chế riêng của họ là hành vi collagenase chỉ trên các mô chứa collagen, khi pronase liên quan đến tính đầy đủ của sự phân tán của một số dòng tế bào biểu mô liên tục với kém hơn so với trypsin (Foley và Aftonomos, 1970). Trong 20 năm qua như vậy, đã có một số rất ít điều tra về các ứng dụng của protease từ vi khuẩn trong nuôi cấy tế bào động vật (Chiplonkar et al, 1985;. Nestler et al, 2004;. Shankar et al, 2011). và họ đã được tất cả từ nguồn gốc nấm . Cho đến nay, vẫn chưa có báo cáo về việc sử dụng protease từ các loài vi khuẩn Vibrio trong lĩnh vực này. Hơn nữa, như các protease kiềm từ vi khuẩn Vibrio sp. (V26) trưng bày 'detachase' tài sản trong quá trình nghiên cứu đặc tính; ứng dụng của nó trong phân ly của các tế bào từ các nền văn hóa và các mô của nền văn hóa tế bào sơ cấp tế bào đơn lớp đã được nghiên cứu. Các tế bào tách ra tính chất của protease từ Khoa Sinh học biển, Vi sinh và Hóa sinh 163 Chương 5 ứng dụng của protease kiềm từ vi khuẩn Vibrio sp. (V26) Vibrio sp. (V26) cũng được so sánh với trypsin, một loại enzyme được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy tế bào động vật. 5.1.1 Vật liệu và phương pháp 5.1.1.1 Khảo nghiệm protease Như các ứng dụng trong nuôi cấy tế bào động vật; khảo nghiệm hoạt động đã được thực hiện ở pH 7.2 và 37oC như họ là những điều kiện tối ưu cho các dòng tế bào. Đối với việc khảo nghiệm các enzym 500 ml enzyme pha loãng thích hợp đã được thêm vào 500 ml casein (1%) được chuẩn bị trong PBS (phosphate đệm nước muối) (pH 7,2 ± 0,2) và ủ ở 37oC trong 30 phút. Phần còn lại của thủ tục được nêu trong phần 3.2.2.1. 5.1.1.2 Sản xuất enzyme protease kiềm được sản xuất bằng cách trồng Vibrio sp. (V26) trong biến đổi dinh dưỡng nước dùng (Bảng 4.7) trong điều kiện tối ưu. 5.1.1.3 Các dòng tế bào và mô sử dụng Hep-2 (thanh quản Nhân tế bào biểu mô), HeLa (Henritta Thiếu, con người ung thư cổ tử cung) và RTG-2 (dòng tế bào gonadial có nguồn gốc từ Oncorhynchus mykiss) dòng tế bào đã được sử dụng trong việc điều tra. Dòng tế bào được duy trì trong môi trường MEM ​​của Eagle cùng với 2 mM glutamine, 1,5 g / L natri bicarbonate và 10% FBS. Tế bào Hep-2 và HeLa được duy trì ở 37oC trong khi RTG-2 tế bào được nuôi cấy ở nhiệt độ 25oC. Chín ngày gà cũ phôi được sử dụng cho sự phát triển của phôi gà nuôi cấy tế bào sơ cấp nguyên bào sợi. Các phương pháp tiếp cho các ứng dụng của các enzyme trong nuôi cấy tế bào và bảo trì của họ là theo các giao thức chuẩn được mô tả bởi Freshney (2000). 5.1.1.4 Các enzyme để nghiên cứu nuôi cấy tế bào Alkaline protease từ vi khuẩn Vibrio sp. (V26) (APV26): Các tế bào bề miễn phí đã bị kết tủa với amoni sulfat (40-80%) và kết tủa tan trong một lượng tối thiểu của Tris-Cl đệm (pH 8.5). Đây là Khoa Sinh học biển, Vi sinh và Hóa sinh 164 Chương 5 ứng dụng của protease kiềm từ vi khuẩn Vibrio sp. (V26) sau đó diafiltered và tập trung sử dụng Amicon UF khuấy di động (Model 8010) với 10 kDa cắt màng chống Tris-Cl đệm (pH 8.5). Các enzyme tập trung đạt lyoph