TAXOID HYDROXYLASESThe first invest

TAXOID HYDROXYLASES
The first investigations focusing on the hydroxylation of
the taxadiene core were carried out with cell-free extracts
of T. brevifolia and T. cuspidata (Hefner et al., 1996; Lovy
Wheeler et al., 2001). Using microsomal preparations of
T. brevifolia stem and plant cell cultures, the first
oxygenation reaction of taxadiene was identified as 5-hydroxylation (Hefner et al., 1996). Characterization of
the oxygenase activity could be conclusively identified by
carbon monoxide inhibition and the reversal of enzymatic
activity by irradiation with blue (450 nm) light and the
oxygenase as a cytochrome P450-dependent
monooxygenase (Hefner et al., 1996). Further
biochemical studies using 5-hydroxy-taxadiene and its
acetate ester identified the following oxygenation
reactions, 13-hydroxylation and 10
-hydroxylation,
respectively. Thus, using 5-hydroxy-taxadiene and 5-acetoxy-taxadiene as substrates in the microsomal
preparations, 5,13-dihydroxy-taxadiene and 5-acetoxy-10
-hydroxy-taxadiene were yielded, respec-tively (Figure 3) (Wheeler et al., 2001). The predominant
roles of cytochrome P450s in catalyzing oxidation and
hydroxylation reactions in plant secondary metabolic
pathways are well established; however, purification of
the enzymes from the plant microsomal fractions often
proved difficult. Thus, to circumvent the obstacle of
purification of the individual cytochrome P450 hydro-xylases involved in taxol and taxoid biosynthesis, a
molecular biology approach based on gene cloning,
heterologous functional expression and enzyme
functional testing was used. For the cloning of potential
cytochrome P450 genes involved in the taxol biosyn-thesis, three complementary cloning approaches were
applied. Taxol biosynthesis in plant cell culture is
significantly increased in response to methyl jasmonate
exposure (Yukimune et al., 1996). Using a differential
display protocol for the specific cloning of cytochrome
P450 genes (Schopfer and Ebel, 1998) and methyl
jasmonate-elicited and nonelicited T. cuspidata cell
cultures, several methyl jasmonate-induced cytochrome
P450 partial clones were isolated, from which full-length
cDNA clones were then obtained by traditional cDNA
library screening (Schoendorf et al., 2001). This approach
resulted in the isolation of the taxoid 10
-hydroxylase
(Schoendorf et al., 2001) and 13-hydroxylase
(Jennewein et al., 2001). An alternative approach for the
isolation of cytochrome P450 genes of the taxol
biosynthetic pathway took advantage of highly conserved
sequence regions of the cytochrome P450s (Holton and
Lester, 1996). Using degenerate PCR primers designed from two highly conserved domains (the PERF motif and
the heme-binding motif), several cytochrome P450 partial
sequences could be isolated, from which the full-length
clones were obtained also by traditional cDNA library
screening (Jennewein et al., 2004a). In addition to the
specific cloning of Taxus cytochrome P450 genes,
random sequencing of a cDNA library from methyl
jasmonate-induced T. cuspidata cell culture identified
additional cytochrome P450 clones (Jennewein et al.,
2004b). With the three chosen approaches, nearly 30
very similar (similarity >70%) candidates for cytochrome
P450 genes with potential relevance to taxoid
biosynthesis were obtained and most of the cloned genes
were identified by all three approaches. The biosynthesis
of taxol involves approximately nine oxygenation
reactions, thus implying significant redundancy in hydro-xylase functions. This redundancy in function was already encountered by the isolation of two different cytochrome
P450 genes that encode a taxoid 10
-hydroxylase
(Schoendorf et al., 2001; Jennewein et al., 2004b) and
several very closely related sequences that code for
taxoid 2-hydroxylase (Chau and Croteau, 2004). The
obtained Taxus cytochrome P450 genes were then
functionally co-expressed with a NADPH: cytochrome
P450 reductase either in the Spodoptera frugiperda
baculovirus insect cell expression system (Jennewein et
al., 2001) or in S. cerevisiae (baker’s yeast) (Schoendorf
et al., 2001; Jennewein et al., 2003). The insect cell
expression system proved to be superior with regards to
microsomal fraction preparation, whereas the yeast-based expression offered the advantage of using the
more simple method of in vivo feeding of the radioactively
labeled taxoid substrates for functional testing of the
heterologous expressed cytochrome P450 genes.

Kết quả (Việt) 2:

TAXOID HYDROXYLASES
Các cuộc điều tra đầu tiên tập trung vào các hydroxyl hóa
cốt lõi taxadiene được thực hiện với chất chiết xuất từ tế bào miễn phí
của T. brevifolia và T. cuspidata (Hefner et al 1996,;. Lovy
Wheeler et al., 2001). Sử dụng các chế phẩm microsome của
T. brevifolia thân và nuôi cấy tế bào thực vật, là người đầu tiên
phản ứng oxy hóa của taxadiene được xác định là 5? -hydroxylation (Hefner et al., 1996). Đặc tính của
các hoạt động oxygenase có thể được kết luận xác định bởi
sự ức chế carbon monoxide và các đảo ngược của enzyme
hoạt động bằng cách chiếu xạ với màu xanh (450 nm) ánh sáng và
oxygenase như một cytochrome P450-phụ thuộc
monooxygenase (Hefner et al., 1996). Hơn nữa
nghiên cứu sinh hóa sử dụng 5? -hydroxy-Taxadiene và nó
ester acetate xác định được sự oxy hóa sau
phản ứng, 13 -hydroxylation? Và 10? -hydroxylation,
Tương ứng. Vì vậy, sử dụng 5? -hydroxy-Taxadiene và 5? -acetoxy-Taxadiene làm chất nền trong microsome
chuẩn bị, 5?, ​​13? -dihydroxy-Taxadiene và 5? -acetoxy-10? -hydroxy-Taxadiene đã mang lại, respec-cực (Hình 3) (Wheeler et al., 2001). Chiếm ưu thế
vai trò của cytochrome P450s xúc tác quá trình oxy hóa và
hydroxy hóa các phản ứng trao đổi chất thứ cấp trong nhà máy
đường là cũng được thành lập; Tuy nhiên, thanh lọc của
các enzym từ các phần phân đoạn microsome cây thường
tỏ ra khó khăn. Vì vậy, để phá vỡ những trở ngại để
thanh lọc của cytochrome P450 cá nhân thủy xylases liên quan đến sinh tổng hợp taxol và taxoid, một
cách tiếp cận sinh học phân tử dựa trên nhân bản gen,
biểu hiện chức năng và dị loại enzyme
chức năng kiểm tra được sử dụng. Đối với các nhân bản của tiềm năng
gen cytochrome P450 tham gia vào các taxol biosyn luận án, ba phương pháp nhân bản bổ sung được
áp dụng. Taxol sinh tổng hợp trong nuôi cấy tế bào thực vật được
tăng lên đáng kể để đáp ứng với methyl jasmonate
tiếp xúc (Yukimune et al., 1996). Sử dụng một khác biệt
giao thức hiển thị cho các nhân bản cụ thể của cytochrome
gen P450 (Schopfer và Ebel, 1998) và methyl
jasmonate-gợi ra và nonelicited T. cuspidata tế bào
nền văn hóa, một số methyl jasmonate gây ra cytochrome
P450 nhái một phần đã bị cô lập, từ đó độ dài đầy đủ
cDNA sau đó dòng vô tính đã thu được bằng cách truyền thống cDNA
sàng lọc thư viện (Schoendorf et al., 2001). Cách tiếp cận này
dẫn đến sự cô lập của taxoid 10? -hydroxylase
Và 13 (Schoendorf et al., 2001)? -hydroxylase
(Jennewein et al., 2001). Một cách tiếp cận thay thế cho
cách ly của các gen cytochrome P450 của taxol
trình tổng hợp đã tận dụng được bảo tồn
vùng trình tự của các cytochrome P450s (Holton và
Lester, 1996). Sử dụng đoạn mồi PCR thoái hóa thiết kế từ hai lĩnh vực có tính bảo tồn (các motif PERF và
các motif heme-ràng buộc), một số cytochrome P450 một phần
trình tự có thể được cô lập, từ đó độ dài đầy đủ
dòng vô tính đã thu được cũng bởi truyền thống thư viện cDNA
sàng lọc (Jennewein et al ., 2004a). Ngoài các
nhân bản cụ thể của gen P450 Taxus cytochrome,
trình tự ngẫu nhiên của một thư viện cDNA từ methyl
văn hóa jasmonate gây ra tế bào T. cuspidata xác định
thêm nhái cytochrome P450 (Jennewein et al.,
2004b). Với ba phương pháp được lựa chọn, gần 30
rất giống nhau (tương tự> 70%) cho các ứng cử viên cytochrome
gen P450 với phù hợp tiềm năng taxoid
sinh tổng hợp thu được và phần lớn các gen nhân bản vô tính
đã được xác định bởi cả ba phương pháp tiếp cận. Sinh tổng hợp
taxol có gần chín oxy
phản ứng, do đó hàm ý dư thừa đáng kể trong chức năng hydro-xylase. Dư thừa trong chức năng này đã được bắt gặp bởi sự cô lập của hai cytochrome khác nhau
gen P450 mã hoá một taxoid 10 -hydroxylase?
(Schoendorf et al, 2001;.. Jennewein et al, 2004b) và
một số rất chặt chẽ liên quan đến các chuỗi mã đó cho
taxoid 2 ? -hydroxylase (Châu và Croteau, 2004). Các
gen cytochrome P450 Taxus thu được là sau đó
có chức năng đồng thể hiện với một NADPH: cytochrome
P450 reductase hoặc trong Spodoptera frugiperda
(Jennewein et hệ thống baculovirus biểu hiện tế bào côn trùng
al., 2001) hoặc trong S. cerevisiae (men bánh mì) (Schoendorf
et al ., 2001; Jennewein et al, 2003).. Các tế bào côn trùng
hệ thống biểu hiện chứng tỏ được cấp trên liên quan đến
việc chuẩn bị microsome phần, trong khi các biểu hiện men dựa trên cung cấp các lợi thế của việc sử dụng các
phương pháp đơn giản hơn trong cơ thể kiếm ăn của phóng xạ
nền taxoid dán nhãn cho thử nghiệm chức năng của
dị bày tỏ cytochrome P450 gen.