Multilocus restriction typing.All o

Multilocus restriction typing.
All of the E. coli O147 strains (strain set 1 plus the additional strains isolated prior to 1996) were analyzed using multilocus restriction typing (MLRT) (5). The seven housekeeping genes were selected for analysis based on previous work by Reid et al. (13). Primers were designed using DNAMAN software (Lynnon Corp., Quebec, Canada) and were selected from the published sequence of the E. coli K12 (strain MG1655) genome (Table ​(Table1).1). DNA was isolated from each of the strains, and a 50-μl PCR was performed for each of the seven genes. The PCR mixture included bacterial DNA, 0.015 μM of each primer, 0.2 mM of deoxynucleoside triphosphates (Roche, Switzerland), 3 mM of MgCl, 1× Amplitaq Gold Buffer, and 2.5 U Amplitaq Gold DNA polymerase (Perkin-Elmer, Branchburg, N.J.). After initial incubation at 95°C for 10 min, 40 amplification cycles were run, each including denaturing at 94°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and extension at 72°C for 90 seconds. A final extension was done at 72°C for 10 min, and the samples were held at 4°C until they were analyzed. The gene products were resolved on a 2% agarose gel, and the DNA bands were visualized by staining the gel with ethidium bromide. Gene products (20 μl) were incubated with 5 U of either HpaII or HhaI restriction enzyme (Table ​(Table1)1) in the appropriate buffer at 37°C overnight, and the restriction fragments were separated on a 4% agarose gel. The decision to use a particular restriction enzyme for fragmenting a PCR product was based on the banding pattern predicted for that PCR product by the E. coli K12 sequence. E. coli MG1655 was used as a positive control, and E. coli O157:H7 strain 933 was included as an outlier.

Kết quả (Việt) 1:

Multilocus hạn chế gõ.Tất cả các chủng E. coli O147 (căng set 1 cộng thêm chủng bị cô lập trước năm 1996) được phân tích bằng cách sử dụng giới hạn multilocus cách gõ (MLRT) (5). Bảy vệ sinh gen đã được lựa chọn để phân tích dựa trên công việc trước đây của Reid et al. (13). Chất nền, mồi được thiết kế bằng cách sử dụng phần mềm DNAMAN (Lynnon Corp., Quebec, Canada) và đã được lựa chọn từ trình tự xuất bản của E. coli K12 (căng MG1655) gen (bảng (Table1).1). DNA được cô lập từ mỗi của các chủng, và một 50-μl PCR được thực hiện cho mỗi của các gen bảy. Hỗn hợp PCR bao gồm vi khuẩn DNA, 0.015 μM mỗi mồi, cách 0.2 mM deoxynucleoside triphosphates (Roche, Thụy Sỹ), 3 mM MgCl, 1 × Amplitaq vàng đệm và 2.5 U Amplitaq vàng DNA polymerase (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ). Sau khi ủ bệnh ban đầu tại 95° C trong 10 phút, 40 khuếch đại chu kỳ được điều hành, mỗi bao gồm denaturing 94° c trong 30 giây, làm cho deo tại 55° C cho 30 giây, và phần mở rộng ở 72° C trong 90 giây. Một phần mở rộng cuối cùng đã được thực hiện tại 72° C trong 10 phút, và các mẫu được tổ chức tại 4° C cho đến khi họ đã được phân tích. Các sản phẩm gen đã được giải quyết trên gel agarose 2%, và các ban nhạc DNA đã được hình dung bởi nhuộm gel với bromua ethidium. Sản phẩm gen (20 μl) đã ủ với 5 U enzyme giới hạn hoặc HpaII hoặc HhaI (bảng (Table1) 1) trong vùng đệm thích hợp ở 37° C qua đêm, và hạn chế mảnh vỡ đã được tách ra trên gel agarose 4%. Quyết định sử dụng một loại enzyme giới hạn cụ thể phân mảnh một sản phẩm PCR được dựa trên các mô hình dải dự đoán cho rằng sản phẩm PCR bởi dãy E. coli K12. E. coli MG1655 được sử dụng như một điều khiển tích cực, và E. coli O157: H7 căng 933 được bao gồm như là một outlier.

Kết quả (Việt) 2:

Multilocus hạn chế đánh máy.
Tất cả các chủng O147 E.coli (chủng thiết lập 1 cộng với các chủng thêm bị cô lập trước năm 1996) được phân tích bằng multilocus gõ hạn chế (MLRT) (5). Bảy gen Dọn dẹp phòng hàng đã được lựa chọn để phân tích dựa trên công việc trước đây của Reid et al. (13). Mồi được thiết kế sử dụng phần mềm DNAMAN (Lynnon Corp, Quebec, Canada) và đã được lựa chọn từ các trình tự công bố của E. coli K12 (chủng MG1655) hệ gen (Table (Bảng 1) .1). DNA được phân lập từ mỗi chủng, và một PCR 50 ml đã được thực hiện cho mỗi một trong bảy gen. Các hỗn hợp PCR bao gồm DNA của vi khuẩn, 0.015 mM của mỗi lớp sơn lót, 0,2 mM triphosphate deoxynucleoside (Roche, Thụy Sĩ), 3 mM MgCl, 1 × Amplitaq Vàng đệm, và 2,5 U Amplitaq vàng DNA polymerase (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ ). Sau khi ủ ban đầu ở 95 ° C trong 10 phút, 40 chu kỳ khuếch đại đã được chạy, bao gồm biến tính ở 94 ° C trong 30 giây, ủ ở 55 ° C trong 30 giây, và mở rộng ở 72 ° C trong 90 giây. Một phần mở rộng cuối cùng đã được thực hiện ở 72 ° C trong 10 phút, và các mẫu được tổ chức tại 4 ° C cho đến khi họ được phân tích. Các sản phẩm gen đã được giải quyết trên gel agarose 2%, và các băng DNA được hình dung bằng cách nhuộm gel với ethidium bromide. Sản phẩm gen (20 ml) được ủ với 5 U của một trong hai HpaII hoặc HhaI hạn chế enzyme (Table (Bảng 1) 1) trong bộ đệm thích hợp ở 37 ° C qua đêm, và các mảnh vỡ hạn chế đã được tách trên gel agarose 4%. Quyết định sử dụng một enzyme giới hạn đặc biệt đối với phân mảnh một sản phẩm PCR được dựa trên mô hình dải dự đoán cho rằng sản phẩm PCR bằng chuỗi E. coli K12. E. coli MG1655 đã được sử dụng như một điều khiển tích cực, và E. coli O157: H7 căng 933 đã được đưa vào như một outlier.