DNA extraction. The lymph node spec

DNA extraction. The lymph node specimens were cut into small pieces by using a sterile scalpel blade. Approximately 40 mg of tissue was then washed twice in 0.5 ml of sterile phosphate buffered saline (PBS); and the tissue was treated with 500 g/ml of proteinase K (Sigma) in 1 ml of 10 mM Tris HCl (pH 8.0) containing 0.5% Nonidet P-40 (Sigma), 0.5% Tween 20, 50 mM KCl, and 50mM MgCl2 at 55°C and with 30 s of vigorous shaking every 15 min for2hor until the tissue was entirely digested. The DNA was extracted with phenol-chloroform, ethanol precipitated, air dried, resuspended in 40 l of TE buffer (10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA), and heated to 95°C for 10 min. A 3-l aliquot of this suspension was amplified by PCR.PCR primers and hybridization probe. The detection of B. henselae in CSD lymph nodes with the primers and internal hybridization probe employed in this study has previously been described by Anderson et al. (3). These primers target a 414-bp fragment in the htrA gene of B. henselae.
DNA amplification. A3-l aliquot of the DNA suspension extracted from a
lymph node tissue sample was used as the template for 40 cycles of DNA
amplification. PCR amplification was performed in 20 M Tris HCl (pH 8.4)
containing 50 mM KCl, 3 mM MgCl2, 1.5 units of Taq polymerase (Invitrogen,
Cergy Pontoise, France), 0.2 M of each primer, and 0.2 M of each of the four
deoxyribonucleotides in a final volume of 100 l.
To avoid DNA contamination of the samples, the precautions recommended
by Kwok and Higuchi (17) were taken. Sample preparation, PCR amplification,
and electrophoresis were performed with separate sets of pipettes and the wear-
ing of protective laboratory coats and caps in three different closed rooms where
B. henselae had never been cultured. At each step of sample preparation, each
tube was carefully and separately uncovered. Gloves were changed between the
handling of each sample, and all solutions were manipulated by using pipettes
with hydrophobic filter tips (Multiguard; Sorenson).

Kết quả (Việt) 1:

Khai thác DNA. Các mẫu vật hạch đã được cắt thành miếng nhỏ bằng cách sử dụng một lưỡi dao vô trùng. Xấp xỉ 40 mg mô sau đó được rửa hai lần trong cách 0.5 ml dung dịch muối vô trùng phosphat đệm (PBS); và các tế bào đã được điều trị với 500 g/ml proteinase K (Sigma) trong 1 ml 10 mM Tris HCl (pH 8,0) chứa 0.5% Nonidet P-40 (Sigma), cách 0.5% giữa 20, 50 mM KCl và 50 mM MgCl2 55 ° C và với 30 s của mạnh mẽ run rẩy mỗi for2hor 15 phút cho đến khi các mô được tiêu hóa hoàn toàn. DNA được chiết xuất với phenol-chloroform, ethanol kết tủa, máy sấy khô, resuspended ở 40 l TE đệm (10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) và đun nóng đến 95° C trong 10 phút. Một 3-l aliquot của hệ thống treo này là amplified bởi Đảng Cộng sản Romania. Chất nền, mồi PCR và lai ghép thăm dò. Phát hiện B. henselae tại CSD hạch bạch huyết với chất nền, mồi và thăm dò nội lai ghép được sử dụng trong nghiên cứu này trước đây đã được mô tả bởi Anderson et al. (3). Các chất nền, mồi nhắm mục tiêu một mảnh 414-bp trong htrA gen của B. henselae.DNA amplification. A3-l aliquot của hệ thống treo DNA được chiết xuất từ mộthạch mô mẫu được sử dụng như các mẫu trong các chu kỳ 40 DNAamplification. Amplification Đảng Cộng sản Romania được thực hiện ở 20 M Tris HCl (pH 8.4)có 50 mM KCl, 3 mM MgCl2, 1.5 đơn vị của Taq polymerase (Invitrogen,Cergy Pontoise, Pháp), cách 0.2 M mỗi mồi và cách 0.2 M của mỗi trong bốndeoxyribonucleotides trong một thể tích ngoài 100 l.Để tránh ô nhiễm các mẫu DNA, các biện pháp phòng ngừa được đề nghị.bởi Kwok và Higuchi (17) đã được thực hiện. Chuẩn bị mẫu, PCR amplification,và electrophoresis đã được thực hiện với bộ ống lấy và mặc-ing bảo vệ phòng thí nghiệm áo khoác và mũ trong ba khác nhau đóng cửa phòng màB. henselae đã không bao giờ được nuôi cấy. Tại mỗi bước chuẩn bị mẫu, mỗiống được phát hiện ra một cách cẩn thận và riêng biệt. Găng tay đã được thay đổi giữa cácxử lý của mỗi mẫu, và tất cả các giải pháp đã được chế tác bằng cách sử dụng ống Lấyvới lời khuyên kỵ nước filter (Multiguard; Sorenson).

Kết quả (Việt) 2:

Tách chiết DNA. Các mẫu vật hạch bạch huyết được cắt thành miếng nhỏ bằng cách sử dụng một lưỡi dao vô trùng. Khoảng 40 mg mô sau đó đã được rửa hai lần trong 0,5 ml vô trùng phosphate nước muối đệm (PBS); và các mô đã được điều trị bằng 500? g / ml proteinase K (Sigma) trong 1 ml 10 mM Tris HCl (pH 8,0) chứa 0,5% Nonidet P-40 (Sigma), 0,5% Tween 20, 50 mM KCl, và 50mM MgCl2 ở 55 ° C và có được 30 giây mạnh mẽ lắc mỗi for2hor 15 phút cho đến khi các mô đã hoàn toàn tiêu hóa. DNA được chiết xuất với phenol-chloroform, ethanol kết tủa, sấy khô không khí, lơ lửng trong 40? L đệm TE (10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA), và đun nóng đến 95 ° C trong 10 phút. Một dịch chất 3? L của hệ thống treo này là ampli ed fi bằng mồi PCR.PCR và probe. Các phát hiện của B. henselae trong hạch bạch huyết CSD với mồi và probe nội dụng nghiên cứu này trước đây đã được mô tả bởi Anderson et al. (3). Những mồi nhắm mục tiêu một đoạn 414 bp gen htrA của B. henselae.
DNA ampli fi cation. A3-? L dịch chất của việc đình chỉ DNA chiết xuất từ một
mẫu mô hạch được sử dụng làm mẫu cho 40 chu kỳ của DNA
ampli fi cation. PCR ampli fi cation đã được thực hiện trong 20? M Tris HCl (pH 8.4)
có chứa 50 mM KCl, 3 mM MgCl 2, 1,5 đơn vị Taq polymerase (Invitrogen,
Cergy Pontoise, Pháp), 0,2? M mồi, và 0,2? M của mỗi trong bốn
deoxyribonucleotides trong một thể tích nal fi 100? l.
Để tránh ô nhiễm DNA của các mẫu, các biện pháp phòng ngừa nên
bởi Kwok và Higuchi (17) đã được thực hiện. Chuẩn bị mẫu,
PCR ampli fi cation, và hiện tượng điện được thực hiện với bộ riêng biệt của pipet và wear-
ing của áo khoác phòng thí nghiệm bảo vệ và mũ trong ba phòng khép kín khác nhau, nơi
B. henselae đã không bao giờ được nuôi. Tại mỗi bước chuẩn bị mẫu, mỗi
ống đã được cẩn thận và riêng biệt phát hiện. Găng tay đã được thay đổi giữa các
xử lý của mỗi mẫu, và tất cả các giải pháp đã được chế tác bằng cách sử dụng pipet
với lời khuyên kỵ fi lter (Multiguard; Sorenson). mỗi ống đã được cẩn thận và riêng biệt phát hiện. Găng tay đã được thay đổi giữa các xử lý của mỗi mẫu, và tất cả các giải pháp đã được chế tác bằng cách sử dụng pipet với lời khuyên kỵ fi lter (Multiguard; Sorenson). mỗi ống đã được cẩn thận và riêng biệt phát hiện. Găng tay đã được thay đổi giữa các xử lý của mỗi mẫu, và tất cả các giải pháp đã được chế tác bằng cách sử dụng pipet với lời khuyên kỵ fi lter (Multiguard; Sorenson).

Kết quả (Việt) 3:

Chiết xuất của DNA.Hạch bạch huyết mẫu vật bị cắt ra từng mảnh nhỏ dùng dao phẫu thuật vô trùng.Khoảng 40 mg tổ chức, sau đó dùng 0.5 ml vô trùng phosphate đệm nước muối tắm hai lần (PBS); và tổ chức là 500 gam / CC Proteinase K với (Sigma) trong 10 mM Tris-HCl (pH 8) 1 mL ham 0.5% NONIDET P-40 (Sigma), 0.5% 20, 50 mm kali clorua, và 50mm clorua magiê ở 55 ° C và 30 kịch liệt lắc mỗi 15 phút cho đến khi hoàn toàn bị tiêu for2hor tổ chức.Sử dụng phương pháp chiết DNA phenol - chloroform, kết tủa ethanol, không khí khô, lơ lửng trong 40 L của đệm te (10 mM Tris-HCl, giá trị pH 8, 1 mm EDTA), và đun nóng đến 95 ° C 10 phút, 3-L treo này chia đều pcr.pcr khuếch đại của fi mồi và máy thăm dò.Hạch bạch huyết ở CSD trong đoạn mồi và Probe đã được dùng trong nghiên cứu của B. cả vật thể phát hiện đã bị Anderson et al đã mô tả.(3).Những đoạn mồi trong mục tiêu cả vật thể HtrA ca một đoạn gen 414.Khuếch đại DNA fi.A3-l chia đều bị đình chỉ trích của DNAHạch bạch huyết và tổ chức cho mẫu vật, với 40 một giai đoạn DNAKhuếch đại fi.Khuếch đại PCR fi ở 20 m Tris-HCl (pH 8.4) tiến hànhCó 50 mM KCl, MgCl2 3 mm, 1,5 đơn vị Taq polymerase (Invitrogen,Cergy Pontoise, Pháp), 0.2 mét và 0.2 mét, mọi con mồi, 4 người.Ở fi khối lượng NAL cho 100 của L - deoxy - ribonucleotideĐể tránh ô nhiễm mẫu DNA, đề nghị các biện pháp phòng ngừaBy Kwok và Higuchi (17).Mẫu chuẩn bị, khuếch đại PCR fi,Với chất lỏng điện sang ống và hao mòn tiến hành đặt riêng...Trong ba người khác trong phòng kín để bảo vệ phòng thí nghiệm nón và áo khoácB. cả vật thể chưa bao giờ được huấn luyện.Trong mỗi mẫu chuẩn bị bước, mỗi bước.Ống dẫn bị cẩn thận và một mình tìm ra.Găng tay thay đổi giữaMỗi mẫu xử lý, tất cả các giải pháp sử dụng thiết bị chuyển dịch là qua hoạt động củaBộ lọc fi Mẹo (multiGUARD; Sorenson).