EBV relies on EBNA1 for maintenance

EBV relies on EBNA1 for maintenance of the viral episome. EBNA1 is a well-studied protein that is consistently expressed in EBV-infected cells, including all EBV-associated malignancies [38, 52–54]. Indeed, selective EBNA1 inhibition via siRNAs [55], small molecule inhibitors [56, 57], or dominant-negative forms of the protein [58] impairs EBV latency and results in a loss of EBV episomes from infected cells. In the present study, we show that the CRISPR/Cas9 system can indeed target the EBNA1 protein-coding sequence or regulatory EBNA1 binding sites on the EBV genome, as a means to inhibit EBV episome maintenance. We show that the CRISPR/Cas9 system can target and edit EBV genes in naturally EBV-transformed cells of lymphoid and epithelial origin. Taken into account that the gastric carcinoma cell line SNU719 carries ±800 EBV genomes/cell [59], the efficiency of editing was high. Indeed, targeting of the essential EBNA1 gene using a single gRNAs in Akata-Bx1 cells resulted in 50–60% loss of latent EBV from cells. However, a proportion of the cells still contained EBV, which could be either wt unedited EBV, or mutant EBV that has received CRISP/Cas9-mediated mutations at the target region while retaining EBNA1 activity (e.g. by in an in-frame deletion). Subsequent introduction of a second gRNA targeting a different region on the EBNA1 gene, however, further enhanced the removal to up to 95% of EBV genomes. We hypothesize that simultaneous administration of multiple anti-EBV gRNAs into latently infected cells will further enhance the destabilization of EBV episomes and may facilitate complete eradication of the virus. This clearance could result in the loss of EBV-driven tumorigenic, cell cycle-promoting functions, anti-apoptotic features, and anti-inflammatory functions of EBV-encoded gene products and as such may serve as a new therapeutic strategy to combat EBV-associated malignancies. Indeed, an independent study showed that transient transfection of multiple anti-EBV gRNAs cleared EBV from a small subset of latently infected Raji B-cells, thereby inducing a proliferation arrest in these cells [29]. Our approach relies on stable expression of anti-EBV gRNAs via lentiviral vectors and induces an almost complete loss of EBV episomes, suggesting that a further optimization of this approach may allow for the complete removal of EBV from human cells.

Kết quả (Việt) 1:

EBV dựa trên EBNA1 cho duy trì episome virus. EBNA1 là một protein được nghiên cứu một cách nhất quán được bày tỏ trong các tế bào nhiễm EBV, bao gồm tất cả liên quan đến EBV khối u ác tính [38, 52-54]. Thật vậy, ức chế EBNA1 chọn lọc thông qua siRNAs [55], ức chế phân tử nhỏ [56, 57] hoặc tiêu cực chi phối các hình thức của protein [58] làm suy yếu EBV trễ và kết quả là một mất mát của EBV episomes từ các tế bào bị nhiễm bệnh. Trong nghiên cứu hiện nay, chúng tôi thấy rằng hệ thống CRISPR/Cas9 có thể thực sự nhắm mục tiêu các trình tự mã hóa protein EBNA1 hoặc EBNA1 ràng buộc pháp lý các trang web trên gen EBV, như một phương tiện để ức chế EBV episome bảo trì. Chúng tôi thấy rằng hệ thống CRISPR/Cas9 có thể nhắm mục tiêu và chỉnh sửa EBV gen trong tế bào tự nhiên chuyển EBV xứ bạch huyết và biểu mô. Đưa vào tài khoản dòng tế bào ung thư biểu mô Dạ dày SNU719 mang ±800 EBV bộ gen/di động [59], hiệu quả của chỉnh sửa là cao. Thật vậy, mục tiêu của các gen EBNA1 cần thiết bằng cách sử dụng một gRNAs duy nhất trong các tế bào Akata-Bx1 làm mất 50 – 60% EBV tiềm ẩn từ các tế bào. Tuy nhiên, một tỷ lệ của các tế bào vẫn chứa EBV, đó có thể là một trong hai wt unedited EBV, hoặc đột biến EBV đó đã nhận được sắc nét/Cas9-trung gian đột biến tại khu vực mục tiêu trong khi duy trì hoạt động EBNA1 (ví dụ như bằng ở một trong khung xóa). Tiếp theo giới thiệu của một gRNA thứ hai nhắm mục tiêu một khu vực khác nhau trên các gen EBNA1, Tuy nhiên, tăng cường hơn nữa việc loại bỏ tối đa 95% EBV bộ gen. Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng quản lý đồng thời nhiều anti-EBV gRNAs vào các tế bào bị nhiễm latently sẽ nâng cao hơn nữa destabilization EBV episomes và có thể tạo điều kiện xóa bỏ hoàn toàn virus. Giải phóng mặt bằng này có thể dẫn đến sự mất mát của EBV thúc đẩy tumorigenic, chu kỳ tế bào, thúc đẩy chức năng, tính năng chống chết rụng và các chức năng chống viêm của sản phẩm gen mã hóa EBV và như vậy có thể phục vụ như là một chiến lược điều trị mới để chống lại liên quan đến EBV khối u ác tính. Thật vậy, một nghiên cứu độc lập đã cho thấy rằng transfection thoáng qua nhiều anti-EBV gRNAs xóa EBV từ một tập hợp con nhỏ bị nhiễm latently Raji B-tế bào, do đó gây ra một ngừng gia tăng trong các tế bào [29]. Phương pháp tiếp cận của chúng tôi dựa vào các biểu hiện ổn định của anti-EBV gRNAs qua lentiviral vector và gây ra một thiệt hại gần như hoàn toàn của EBV episomes, cho thấy rằng một tối ưu hóa hơn nữa trong cách tiếp cận này có thể cho phép việc loại bỏ hoàn toàn các EBV từ các tế bào của con người.

Kết quả (Việt) 2:

EBV dựa trên EBNA1 cho bảo trì các episome virus. EBNA1 là một protein được nghiên cứu mà luôn được thể hiện trong các tế bào EBV nhiễm, bao gồm tất cả EBV liên quan đến bệnh lý ác tính [38, 52-54]. Thật vậy, sự ức chế chọn lọc EBNA1 qua siRNAs [55], các chất ức chế phân tử nhỏ [56, 57], hoặc các hình thức chi phối tiêu cực của các protein [58] làm suy yếu độ trễ EBV và kết quả là một sự mất mát của episomes EBV từ các tế bào bị nhiễm bệnh. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cho thấy rằng CRISPR / hệ thống Cas9 thực sự có thể nhắm mục tiêu các EBNA1 trình tự mã hóa protein hoặc ràng buộc EBNA1 trang web quy về hệ gen của EBV, như một phương tiện để ức chế duy trì episome EBV. Chúng tôi thấy rằng các hệ thống CRISPR / Cas9 thể nhắm mục tiêu và chỉnh sửa gen EBV trong tế bào tự nhiên EBV-chuyển của bạch huyết và nguồn gốc biểu mô. Đưa vào tài khoản các dòng tế bào ung thư biểu mô dạ dày SNU719 mang ± 800 gen EBV / di động [59], hiệu quả của biên tập là rất cao. Thật vậy, mục tiêu của gen EBNA1 cần thiết sử dụng một gRNAs đơn trong tế bào Akata-Bx1 dẫn 50-60% mất EBV tiềm ẩn từ các tế bào. Tuy nhiên, một tỷ lệ của các tế bào vẫn còn chứa EBV, mà có thể là một trong hai EBV chưa được chỉnh sửa trọng lượng, hoặc EBV đột biến đó đã nhận được những đột biến CRISP / Cas9 qua trung gian tại các khu vực mục tiêu trong khi giữ lại hoạt động EBNA1 (ví dụ như bằng trong một xóa trong khung). giới thiệu tiếp theo của một gRNA thứ hai nhắm mục tiêu một khu vực khác nhau trên gen EBNA1, tuy nhiên, tăng cường hơn nữa việc loại bỏ lên đến 95% bộ gen EBV. Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng chính quyền đồng thời nhiều chống EBV gRNAs vào các tế bào tiềm tàng nhiễm sẽ tiếp tục tăng cường sự bất ổn của episomes EBV và có thể tạo điều kiện tiêu diệt hoàn toàn virus. giải phóng mặt bằng này có thể dẫn đến sự mất mát của các chức năng EBV-driven gây khối u, tế bào chu kỳ thúc đẩy, tính năng tự hủy hoại, và chức năng chống viêm của sản phẩm gen EBV-mã hóa và như vậy có thể phục vụ như là một chiến lược điều trị mới để chống EBV liên quan khối u ác tính. Thật vậy, một nghiên cứu độc lập cho thấy thâm chuyển tạm thời của nhiều chống EBV gRNAs xóa EBV từ một nhóm nhỏ các tiềm tàng nhiễm Raji B-tế bào, do đó gây ra một vụ bắt giữ phổ biến trong các tế bào [29]. Cách tiếp cận của chúng tôi dựa trên biểu hiện ổn định chống EBV gRNAs qua vector lentivirus và gây ra một sự mất mát gần như hoàn toàn của episomes EBV, gợi ý rằng một tối ưu hóa hơn nữa của phương pháp này có thể cho phép loại bỏ hoàn toàn EBV từ các tế bào của con người.