MATERIALS AND METHODSMaterials3-Met

MATERIALS AND METHODS
Materials
3-Methyl-1-phenyl-2-pyrazolium-5-one
(MCI-186), 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC), O-di-anisidine, hexadeacyltrimethylammonium bromide (HTAB), 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), and (

)-epicatech in were purchased from Sigma Chemical Co. (U.S.A.). Anti-MPO antibody was obtained from Santa Cruz Biotechnology, Inc. (U.S.A.) and secondary antibody and ABC kit from Vec-tor (U.S.A.). Silicone (Xantopren) and hardener (Optosil-
Xantopren Activator) were obtained from Bayer Dental (Ger-many). All other materials were of the highest grade com-mercially available.
Animals
Male Sprague-Dawley rats weighing 260—
280 g were purchased from Orient Co., Ltd. (a branch of Charles River Laboratories; Seoul, Korea). The rats were housed 4 or 5 per cage, allowed free access to water and
food, and maintained under constant temperature (231°C)
and humidity (6010%) under a 12-h light/dark cycle (light on 07.30—19.30 h). Animal treatment and maintenance were in accordance with the Principles of Laboratory
Animal Care (NIH publication No. 85-23, revised 1985) andwith the Animal Care and the Use Guidelines of Kyung Hee University, Korea. Preparation of Herbal Extracts
Dried rhizoma of A.asphodeloides were purchased at the Kyungdong Oriental drug store (Seoul, Korea) in 2003. The material obtained was authenticated by Professor Chang Soo Yook of the Department of Oriental Pharmaceutical Science, College of Phar-
macy, Kyung Hee University, Korea. The voucher specimens
(No. KHOPS-03-017) have been deposited at the herbarium
located in the College of Pharmacy, Kyung Hee University.
Rhizoma were extracted with water for 2 h (80—100 °C).
The extract obtained was filtered and concentrated on a water bath under vacuum then frozen and lyophilized (Eyela, model FD-5N, Japan) to yield a water extract (defined as
WEAA), which was stored at
20 °C until required (yield;
42%). WEAA was standardized as the contents of ane- marsaponin B (molecular weight; 902.794) donated by one author (S.Y. Kim) using a LC/MS instrument (Waters/ZQ
2000), consisting of a Waters M2695 liquid chro-matographed alliance with a Waters 996 photodiode array absorbance monitor placed in series between the chromato-
graph and the quadrupole mass spectrometer. Liquid chro-
matograph separations were made by reversed phase chro- matography column (100 mm2.1 mm, 3mm, Atlantis C18,Waters). The mobile phase consisted of water and acetoni- trile(ACN) in the gradient mode as follows with a flow rateof 0.3 ml/min; 0—15 min, 10% ACN; 15—35 min, 90%ACN; 35—40 min, 10% CAN. The injection volume was10ml. All parameters of the APCI-MS system were opti-mized and selected based on generation of protonated molec-ular ions ([MH]) of the analysis of interest and production
of characteristic fragment ions. The following instrumental parameters were used for APCI-MS detection of ane-marsaponin B in the positive ion mode; capillary, 3.5 kV;
cone, 40 V; hex 1, 20 V; aperture, 0 V; hex 2, 0 V; source temperature, 100 °C; desolation temperature, 500 °C; desolation gas, 600 l/h; cone gas, 40 l/h; low mass resolution, 15.0; high mass resolution, 15.0; ion energy, 0.5; multiplier, 650. Transient Focal Cerebral Ischemia Animals were anesthetized in a chamber with a mixture of N2O and O2(70 : 30) containing 2.5% isoflurane. The middle cerebral ar- tery (MCA) was occluded as described by Nagasawa and Kogure,15)with minor modifications. Briefly, after making a median incision in the neck skin, the right common carotid artery was exposed and a 17-mm-long 4-0 nylon thread with a rounded tip (coated with silicon) inserted from the bifurca-tion to the right MCA. After surgery, rats were allowed to recover from the anesthesia. Two hours after MCA occlusion(MCAO), the thread was removed to allow complete reperfu-sion of the ischemic area under re-anesthesia. Neurological deficits characterized by severe left-sided hemiparesis and right Horner’s syndrome were used as criteria to evaluate the ischemic insult. Rats that did not exhibit behavioral deficits before reperfusion were excluded from the study. Heart rate, arterial blood oxygen saturation of arterial hemoglobin, and ECG were monitored throughout the procedure (SurgiVet, U.S.A.). Body temperature was maintained at 370.5 °Cthroughout surgery by a heating pad (Biomed S.L., Spain).Drug Administration Rats that showed positive neuro- logical signs 2 h after MCAO were randomly divided into control, MCI-186, and WEAA treated groups. For dose-re- sponse studies, WEAA (50, 100, 200, 400 mg/kg) was dis-solved in saline and orally administered promptly prior to reperfusion and again 2 h later. Rats in the control group were given saline orally and rats in the positive control group were given MCI-186 (10 mg/kg, p.o.) using the same time schedule used in the WEAA treated group. To evaluate the

Kết quả (Việt) 2:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
3-metyl-1-phenyl-2-pyrazolium-5-một
(MCI-186), 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua (TTC), O-di-anisidine, hexadeacyltrimethylammonium bromide (HTAB), 1 , 1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), và (
?) - epicatech ở được mua từ Sigma Chemical Co (Mỹ). Anti-MPO kháng thể được thu thập từ Santa Cruz Công nghệ sinh học, Inc (Mỹ) và kháng thể thứ cấp và bộ ABC từ Vec-tor (Mỹ). Silicone (Xantopren) và chất làm cứng (Optosil-
Xantopren Activator) được lấy từ Bayer nha khoa (Ger-nhiều). Tất cả các vật liệu khác là hạng cao nhất com-mercially sẵn.
Loài vật
chuột Nam Sprague-Dawley nặng 260-
280 g được mua từ Orient Co., Ltd (một chi nhánh của phòng thí nghiệm sông Charles, Seoul, Hàn Quốc). Những con chuột được nuôi 4 hoặc 5 mỗi lồng, cho phép truy cập miễn phí để nước và
thức ăn, và duy trì ở nhiệt độ không đổi (23? 1 ° C)
và độ ẩm (60? 10%) dưới 12 h sáng / chu kỳ đen tối (ánh sáng trên 07.30-19.30 h). Xử lý động vật và bảo trì là phù hợp với các nguyên tắc của Phòng thí nghiệm
Chăm sóc động vật (NIH bản số 85-23, sửa đổi năm 1985) andwith Chăm sóc động vật và Hướng dẫn sử dụng của trường đại học Kyung Hee, Hàn Quốc. Chuẩn bị các chiết xuất thảo dược
khô Rhizoma của A.asphodeloides được mua tại các cửa hàng thuốc Đông Kyungdong (Seoul, Hàn Quốc) vào năm 2003. Các tài liệu thu được được xác nhận bởi Giáo sư Chang Soo Yook của Sở Khoa học dược phẩm Đông Phương, Trường Đại Phar-
macy, Đại học Kyung Hee, Hàn Quốc. Các mẫu chứng từ
(số KHOPS-03-017) đã được gửi tại tiêu bản
nằm tại trường Cao đẳng Dược, Đại học Kyung Hee.
Rhizoma được chiết xuất bằng nước cho 2 h (80-100 ° C).
Các chiết xuất thu được đã được lọc và tập trung vào một chậu nước dưới chân không sau đó đông lạnh và đông khô (Eyela, mô hình FD-5N, Nhật Bản) để mang lại một chiết xuất nước (được định nghĩa như
WEAA), được lưu trữ ở 20 ° C cho đến khi yêu cầu? (năng suất;
42%). WEAA đã được tiêu chuẩn hóa như nội dung của ane- marsaponin B (trọng lượng phân tử; 902,794) tặng bởi một tác giả (SY Kim) sử dụng một LC / MS cụ (Waters / ZQ
2000), bao gồm một Waters M2695 lỏng liên minh Chro-matographed với một Waters 996 photodiode màn mảng hấp thụ được đặt trong loạt giữa chromato
đồ thị và phổ tứ cực đại chúng. Lỏng chro-
ly matograph đã được thực hiện bởi giai đoạn đảo ngược cột matography chro- (100 mm? 2.1 mm, 3mm, Atlantis C18, Waters). Pha động gồm nước và trile acetoni- (ACN) ở chế độ gradient như sau với một rateof dòng 0,3 ml / phút; 0-15 phút, 10% ACN; 15-35 phút, 90% ACN; 35-40 phút, 10% CAN. Thể tích tiêm was10ml. Tất cả các thông số của hệ thống APCI-MS là Opti-mized và lựa chọn dựa trên thế hệ của các ion molec-ular proton ([? H M]?) Của các phân tích về lợi ích và sản xuất
của các ion mảnh đặc trưng. Các thông số cụ sau đây được sử dụng cho APCI-MS phát hiện ane-marsaponin B trong chế độ ion dương; mao mạch, 3,5 kV;
nón, 40 V; hex 1, 20 V; khẩu độ, 0 V; hex 2, 0 V; nhiệt độ nguồn, 100 ° C; nhiệt độ hoang vu, 500 ° C; khí hoang vu, 600 l / h; khí hình nón, 40 l / h; độ phân giải khối lượng thấp, 15,0; độ phân giải khối lượng cao, 15,0; ion năng lượng, 0,5; nhân, 650. thoáng Focal não thiếu máu cục bộ gia súc được gây mê trong một căn phòng với một hỗn hợp N2O và O2 (70: 30) có chứa 2,5% isoflurane. Giữa não ar- tery (MCA) đã làm tắc như mô tả của Nagasawa và Kogure, 15) với những thay đổi nhỏ. Tóm lại, sau khi thực hiện một vết mổ trung bình trong da cổ, chung quyền động mạch cảnh được tiếp xúc và 17-mm-dài 4-0 nylon sợi bằng một vành tròn (tráng silicon) đưa vào từ bifurca-tion với MCA đúng . Sau khi phẫu thuật, chuột được cho phép để phục hồi từ gây mê. Hai giờ sau khi MCA tắc (MCAO), các chủ đề đã được loại bỏ để cho phép hoàn reperfu-sion của vùng thiếu máu cục bộ dưới lại gây mê. Loạn thần kinh đặc trưng bởi liệt nửa người bên trái mặt nghiêm trọng và hội chứng Horner đúng được sử dụng như là tiêu chí để đánh giá sự sỉ nhục thiếu máu cục bộ. Những con chuột mà không biểu hiện thiếu hụt về hành vi trước khi tái tưới máu bị loại khỏi nghiên cứu. Nhịp tim, động mạch độ bão hòa oxy trong máu của hemoglobin động mạch, và ECG được theo dõi trong suốt quy trình (SurgiVet, Mỹ). Nhiệt độ cơ thể được duy trì ở mức 37? 0,5 ° Cthroughout phẫu thuật bởi một miếng đệm nóng (Biomed SL, Tây Ban Nha) Chuột Quản trị .Drug cho thấy neuro- dương dấu hiệu hợp lý 2 h sau MCAO được chia ngẫu nhiên vào kiểm soát, MCI-186, và WEAA điều trị nhóm . Đối với nghiên cứu những phản ứng liều lại, WEAA (50, 100, 200, 400 mg / kg) là dis-giải quyết trong dung dịch muối và đường uống kịp thời trước khi tái tưới máu và một lần nữa 2 giờ sau đó. Chuột trong nhóm đối chứng được cho uống nước muối và chuột trong nhóm kiểm soát tích cực đã được đưa MCI-186 (10 mg / kg, po) bằng cách sử dụng lịch thời được sử dụng trong điều trị WEAA nhóm. Để đánh giá