PCR-sequencingIn molecular, PCR seq

PCR-sequencing
In molecular, PCR sequencing is
considered as the gold standard method.
Therefore, at first, PCR-sequencing was
applied in exon 1 region of K-ras on 19
colorectal cancer samples. As the results, we
found out that there was not any mutation at
codon 12, 13 on exon 1 of K-ras where
concentrated 7 prominent mutation (Fig 2).
However, some doubted-peak mutations were
recognized showed in figure 3.
Figure 2. Results of sequencing codon
12, 13 on some sam
34 Journal of Science Ho Chi Minh City Open University – No. 1(13) 2015- February/2015
Figure 3. Some doubted-peak mutations
(Arrow labeled)
According to results, the mutations on
colorectal cancer patients at Tay Ninh Hospital
(Vietnam) were so complex, various and no
specific characteristic (Focus on codon 12, 13
of exon 1 of K-ras) as common reports.
However, concerning to the PCR-sequencing
technique, it was limited when carried out on
those paraffin – embedded tissues, because we
could not observe tissue samples slide on the
lames under the light microscope to isolate the
region where contained more than 70% of
cancer cells in population. According to
Varella Garcia et al., Sanger sequencing
methods could not detect mutation of sample
with the proportion of cancel cells under 25%.
Moreover, samples used were
adenocarcinoma, however, which was lack of
clinical information such as invaded level,
proportion of mutation cells on pathology, HE
staining… Application of sequencing
technique on those samples was so difficult.
Therefore, we tended to confirm the
mutation located on codon 12, 13, which was
detected via sequencing method, by another
one. That is allele specific Real-time PCR
method.
Allele-Specific Real-time PCR (ASRPCR)
Primer designed was the most important
step to successfully carry out the ASR-PCR to
identify the mutation. The results of designing
ASR-PCR primers were showed in table 3.
Parameters of primer pairs such as melting
temperature, length, GC-base pair ratios,
Gibbs Free Energy (ΔG) for secondary
structures (hairpin, self-dimer, and
heterodimer and product’s length were rather
fine for PCR, theoretically.
Table 3. The ASR-PCR primers for seven mutations detection
Mutations Primer (5’-3’) L %GC Tm (1) (2) (3) P
(bp)
G12D
(c.35G>A)
F: AAACTTGTGGTAGTTGGAGCGGA
R: CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG
23
25
47.8
36.0
58.6
52.6
-0.62
0.79
-4.88
-3.91
-10.26 85
G12V
(c.35G>T)
F: AAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGT
R: CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG
23
25
43.5
36.0
56.7
52.6
-0.62
0.79
-4.88
-3.91
-10.26 85
G13D
(c38G>A)
F: GTGGTAGTTGGAGCTGGAGA
R: CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG
20
25
55.0
36.0
56.3
52.6
0.13
0.79
-6.34
-3.91
-6.6 79
G12C
(c.34G>T)
F: AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCCT
R: CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG
27
25
37.0
36.0
56.2
52.6
-0.62
0.79
-4.88
-3.91
-10.26 90
G12S
(c34G>A)
F: AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCGA
R: CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG
27
25
37.0
36.0
56.2
52.6
-0.62
0.79
-4.88
-3.91
-10.26 90
G12A
(c.35G>C)
F: AACTTGTGGTAGTTGGAGCTTC
R: CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG
22
25
45.5
36.0
55.0
52.6
0.5
0.79
-6.34
-3.91
-10.26
84
G12R F: AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTC 27 37.0 .0 -0.62 -9.49 -10.26 90
and in molecularly targeted therapy: from to study 35
Mutations Primer (5’-3’) L %GC Tm (1) (2) (3) P
(bp)
(c34G>C) R: CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG 25 36.0 52.6 0.79 -3.91
Reverse CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG 25 36.0 52.6 0.79 -3.91 -3.61
Reference GACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGA 28 35.7 54.8 -0.62 -4.88 -10.26
Probes CTGTATCGTCAAGGCACT 18 50.0 51.7 0.87 -3.61
Experimentally, we found out that
mutation occurs on codon 12, 13: G12D
(sample 1, 16, 37), G12V (sample 1) and
G12C (sample 16), particularly in sample 1
existed two mutations GD12V and G12V,
sample 16 existed two mutations G12D and
G12C (Figure 4)
Figure 4. The positive results of ASR-PCR on sample 1 and 1

Kết quả (Việt) 1:

Đảng Cộng sản Romania-trình tựTrong phân tử, trình tự PCR làcoi như là phương pháp tiêu chuẩn vàng.Vì vậy, lúc đầu tiên, là Đảng Cộng sản Romania-trình tựáp dụng trong exon 1 vùng của K-ras ngày 19ung thư ruột mẫu. Như là kết quả, chúng tôiphát hiện ra rằng có đã không đột biến bất kỳ lúccodon 12, 13 ngày exon 1 của K-ras nơitập trung các đột biến nổi bật 7 (hình 2).Tuy nhiên, một số đột biến cao điểm nghi ngờđược công nhận cho thấy trong hình 3.Hình 2. Kết quả trình tự codon12, 13 ngày một số sam34 tạp chí khoa học thành phố Hồ Chí Minh Đại học mở-số 1(13) 2015-tháng hai/2015Hình 3. Một số đột biến cao điểm nghi ngờ(Mũi tên có nhãn)Theo kết quả, đột biến vàobệnh nhân ung thư đại-trực tràng tại Tây Ninh bệnh viện(Việt Nam) đã rất phức tạp, khác nhau và không cóđặc tính cụ thể (tập trung vào codon 12, 13của exon 1 của K-ras) như báo cáo phổ biến.Tuy nhiên, liên quan đến để Đảng Cộng sản Romania-trình tựkỹ thuật, nó là giới hạn khi thực hiện trênnhững parafin-nhúng mô, bởi vì chúng tôicó thể không quan sát mô mẫu trượt vào cáclames dưới kính hiển vi ánh sáng để cô lập cáckhu vực nơi có hơn 70%tế bào ung thư trong dân số. TheoĐoàn Garcia et al., Sanger trình tựphương pháp không thể phát hiện các đột biến của mẫuvới tỷ lệ hủy tế bào nhỏ hơn 25%.Hơn nữa, mẫu được sử dụngadenocarcinoma, Tuy nhiên, đó là thiếuCác thông tin lâm sàng chẳng hạn như mức độ xâm lược,tỷ lệ đột biến tế bào trên bệnh lý học, ôngnhuộm... Ứng dụng trình tựkỹ thuật trên các mẫu như vậy khó khăn.Vì vậy, chúng tôi có xu hướng để xác nhận cácđột biến nằm trên codon 12, 13, đó làphát hiện thông qua phương pháp sắp xếp, do người khácmột. Đó là allele cụ thể thời gian thực PCRphương pháp.Dành riêng cho allele Đảng Cộng sản Romania thời gian thực (ASRPCR)Mồi được thiết kế là quan trọng nhấtbước để thành công thực hiện ASR PCR đểxác định các đột biến. Kết quả của thiết kếChất nền, mồi ASR Đảng Cộng sản Romania đã cho thấy trong bảng 3.Các tham số của mồi cặp như nóng chảynhiệt độ, chiều dài, tỷ lệ cặp cơ sở GC,Năng lượng tự do Gibbs (ΔG) cho Trungcấu trúc (mũ, tự-dimer, vàheterodimer và chiều dài của sản phẩm đã thaytốt cho Đảng Cộng sản Romania, lý thuyết.Bảng 3. Các đảng Cộng sản Romania ASR lớp lót cho các phát hiện bảy đột biếnĐột biến mồi (5' - 3') L % GC Tm (1) (2) (3) P(bp)G12D(c.35G > A)F: AAACTTGTGGTAGTTGGAGCGGAR: CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG232547,836.058,652,6-0.620,79-4.88-3.91-10.26 85G12V(c.35G > T)F: AAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGTR: CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG232543.536.056,752,6-0.620,79-4.88-3.91-10.26 85G13D(c38G > A)F: GTGGTAGTTGGAGCTGGAGAR: CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG202555.036.056.352,60,130,79-6.34-3.91-6.6 79G12C(c.34G > T)F: AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCCTR: CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG272537,036.056.252,6-0.620,79-4.88-3.91-10.26 90MUTATION(c34G > A)F: AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCGAR: CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG272537,036.056.252,6-0.620,79-4.88-3.91-10.26 90G12A(c.35G > C)F: AACTTGTGGTAGTTGGAGCTTCR: CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG222545,536.055.052,60,50,79-6.34-3.91-10.2684G12R F: AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTC 27 37,0.0-0.62-9.49-10.26 90và trong phân tử được nhắm mục tiêu trị liệu: từ nghiên cứu 35Đột biến mồi (5' - 3') L % GC Tm (1) (2) (3) P(bp)(c34G > C) R: CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG 25 36.0 52,6 0,79-3.91Đảo ngược CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG 25 36.0 52,6 0,79-3.91-3.61Tham khảo GACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGA 28 35.7 54,8-0.62-4.88-10.26Đầu dò CTGTATCGTCAAGGCACT 18 50.0 51,7 0,87-3.61Thử nghiệm, chúng tôi phát hiện ra rằngđột biến xảy ra trên codon 12, 13: G12D(mẫu 1, 16, 37), G12V (mẫu 1) vàG12C (mẫu 16), đặc biệt là tại mẫu 1tồn tại hai đột biến GD12V và G12V,Mẫu 16 tồn tại hai đột biến G12D vàG12C (hình 4)Hình 4. Các kết quả tích cực của Đảng Cộng sản Romania ASR trên mẫu 1 và 1