A variation of agarose-gel electrop

A variation of agarose-gel electrophoresis, called pulsed-field gel elec-trophoresis, makes it possible to separate even extremely long DNA molecules. Ordinary gel electrophoresis fails to separate such molecules because the steady electric field stretches them out so that they travel end-first through the gel in snakelike configurations at a rate that is independent of their length. In pulsed- field gel electrophoresis, by contrast, the direction of the electric field changes periodically, which forces the molecules to reorient before continuing to move snakelike through the gel. This reorientation takes much more time for larger molecules, so that longer molecules move more slowly than shorter ones. As a consequence, even entire bacterial or yeast chromosomes separate into discrete bands in pulsed-field gels and so can be sorted and identified on the basis of their size (Figure 8-33C). Although a typical mammalian chromosome of 108 base pairs is too large to be sorted even in this way, large segments of these chro¬mosomes are readily separated and identified if the chromosomal DNA is first cut with a restriction nuclease selected to recognize sequences that occur only rarely (once every 10,000 or more nucleotide pairs).
The DNA bands on agarose or polyacrylamide gels are invisible unless the DNA is labeled or stained in some way. One sensitive method of staining DNA is to expose it to the dye ethidium bromide, which fluoresces under ultraviolet light when it is bound to DNA (see Figure 8-33B.C). An even more sensitive detection method incorporates a radioisotope into the DNA molecules before elec¬trophoresis; 32p is often used as it can be incorporated into DNA phosphates and emits an energetic p particle that is easily detected by autoradiography, as in Fig¬ure 8-33. (For a discussion of radioisotopes, see p. 601).

Kết quả (Việt) 1:

Một biến thể của agarose-gel electrophoresis, được gọi là lĩnh vực pulsed gel elec-trophoresis, làm cho nó có thể tách biệt các phân tử ADN thậm chí rất dài. Bình thường gel electrophoresis không tách các phân tử như vậy vì ổn định điện trường trải dài chúng vì vậy mà họ đi du lịch cuối-lần đầu tiên thông qua các gel trong các cấu hình snakelike tại một tỷ lệ đó là độc lập với chiều dài của họ. Trong lĩnh vực pulsed gel electrophoresis, ngược lại, sự chỉ đạo của điện trường thay đổi theo định kỳ, lực lượng các phân tử để reorient trước khi tiếp tục để di chuyển snakelike thông qua các gel. Reorientation này mất nhiều thời gian cho các phân tử lớn hơn, do đó lâu hơn các phân tử di chuyển chậm hơn so với ngắn hơn. Như một hệ quả, thậm chí toàn bộ các vi khuẩn hoặc nấm men nhiễm sắc thể tách thành các ban nhạc rời rạc trong lĩnh vực pulsed gel và vì vậy có thể được sắp xếp và xác định trên cơ sở các kích thước của họ (con số 8-33 C). Mặc dù một nhiễm sắc thể đặc trưng của động vật có vú của 108 cặp cơ sở là quá lớn để được sắp xếp ngay cả trong cách này, các phân đoạn lớn của các chro¬mosomes dễ dàng tách ra và được xác định nếu nhiễm sắc thể ADN đầu tiên cắt với một nuclease hạn chế lựa chọn để nhận ra trình tự chỉ hiếm khi xảy ra (một lần mỗi 10.000 hoặc hơn nucleotide cặp).Ban nhạc DNA agarose hay polyacrylamide gel là vô hình, trừ khi các DNA có nhãn hoặc nhuộm màu trong một số cách. Một trong những phương pháp nhạy cảm nhuộm DNA là tiếp xúc với thuốc nhuộm ethidium bromua, fluoresces dưới tia cực tím ánh sáng khi nó là ràng buộc để ADN (xem hình 8-33B. C). một phương pháp phát hiện nhạy cảm nhiều hơn kết hợp một đồng vị phóng xạ vào các phân tử ADN trước khi elec¬trophoresis; 32p thường được dùng vì nó có thể được tích hợp vào ADN phốt phát và phát ra một hạt năng lượng p một cách dễ dàng được phát hiện bởi autoradiography, như trong Fig¬ure 8-33. (Cho một cuộc thảo luận của các đồng vị phóng xạ, xem p. 601).