To purify WT, DC1, and DC2, we used

To purify WT, DC1, and DC2, we used anion-exchange chromatography as the first step, the Ni2+-Sepharose chromatography
as the second step, and the Strep-Tactin affinity chromatography
as the third step. At each step, each fraction was tested for the
presence of the 25-kDa or 24-kDa protein band by SDS–PAGE,
and the active fractions were pooled based on coomassie staining.
The SDS–PAGE analysis showed that the active fractions from the
WT purification exhibited 25-kDa protein bands (Fig. 2A), and
the purified preparations of WT, DC1, and DC2 exhibited 25-kDa
or 24-kDa protein bands (Fig. 2B). In Fig. 2B, the 50 or 55 kDa faint
bands were also observed; however their origins were unknown.
Then, the N-terminal strep tag and C-terminal (His)10 tag were
removed by successive proteolysis with HRV 3C protease and
thrombin, respectively. After proteolysis, the WT preparation
exhibited a single 22-kDa protein band (Fig. 2C), the DC1 and
DC2 preparations exhibited single 21-kDa protein bands (data
not shown), and the protein bands corresponding to the 50 or
55 kDa faint bands observed in Fig. 2B were not observed (Fig. 2C
for WT and data not shown for DC1 and DC2). From the 2 L cultures, 0.5–1.0 mg of purified WT, DC1, and DC2 were obtained.
In 20 mM Tris–HCl (pH 7.0), 200 mM NaCl, 2.0 mM DTT, and 10%
glycerol, WT, DC1, and DC2 with tags could be concentrated to
1–2 mg/ml, whereas without tags, these proteins could be concentrated to 10 mg/ml (data not shown), indicating that the removing
of the tags increased the solubility.
To examine if the deletion of Ile593–Leu603 or Gly595–Thr605
affects structural change of the isolated RNase H domain, we made
spectroscopic analyses. UV spectroscopy showed that purified WT,
DC1, and DC2 exhibited spectra with a deep trough at approximately 250 nm and a peak at 275 nm (Fig. 3B for WT and data
not shown for DC1 and DC2). CD spectroscopy showed that
46 K. Nishimura et al. / Protein Expression and Purification 113 (2015) 44–50
purified WT, DC1, and DC2 exhibited negative ellipticities at 202–
250 nm with peaks at approximately 208 nm and 222 nm (Fig. 3B
for WT and data not shown for DC1 and DC2). No appreciable
changes were observed in UV and CD) spectra, suggesting that
DC1, and DC2 did not suffer from any global or drastic structural
changes by the deletion.
Characterization of the RNase H domain
To analyze the RNase H activity of the isolated RNase H
domains, we performed fluorescence-based RNase H assay. An
RNA/DNA hybrid (called R18/D18) consisting of a 3 0-fluorescein
modified 18-nt RNA (R18) and a 5 0-dabcyl-modified 18-nt DNA
(D18) was used as the substrate (Fig. 4A). R18/D18 is designed to
emit strong fluorescence when R18 is cleaved at a site close to
the 3 0 end, and the fluorescein-labeled RNA fragment dissociates
from the complementary DNA strand. Fig. 4B shows the difference
in the fluorescence spectra of R18/D18 before and after the reaction. Based on the previous report, the MgCl2 concentration was
set at 5.0 mM [19]. When R18/D18 was incubated without the
full-length RT or the isolated RNase H domain for 30 min, there
was no change in the fluorescence spectra. When R18/D18 was
incubated with 50 nM HIV-1 RT or 1.8 lM WT for 30 min, the fluorescence increased with the peak at 515 nm. When R18/D18 was
incubated with DC1 or DC2 for 30 min, no fluorescence increase
was observed. These results suggest that WT has RNase H activity
and DC1 and DC2 do not.
To further analyze the RNase H activity of the isolated RNase H
domains, we used a radioisotope-based RNase H assay. An
RNA/DNA hybrid (R25/D25) consisting of a 5 0-[32P]-labeled 25-nt
RNA (R25) and an unlabeled complementary DNA (D25) was used
as the substrate (Fig. 5A). After the RNase H reaction, the RNA reaction products were analyzed by denaturing PAGE. First we examined the effects of MgCl2 concentration on the RNase H activity
of WT and found that reactions containing 0.1–0.2 mM yielded
relatively higher amounts of products than those containing other
concentrations (0–15 mM) (data not shown). Thus, 0.1 mM was
used in subsequent experiments.
Fig. 5B shows the denatured PAGE analysis of the products
obtained from the reaction under various conditions. Unreacted
R25/D25 showed only a single 25-nt RNA band. When R25/D25
was incubated with 30 nM full-length MMLV RT, 16–20-nt bands
were detected at 15 s, and 14–17-nt bands were detected at
10 min. When R25/D25 was incubated with 30 nM WT, only a
25-nt band was detected at both 15 s and 10 min. When
R25/D25 was incubated with 1.0 or 10 lM WT, only a 25-nt band
was detected at 15 s, whereas various bands (mainly 7–16-nt
bands) were detected at 10 min. This indicated that the cleavage
pattern of WT was different from that of the full-length MMLV
RT and that the activity of WT was considerably weaker than that
of the full-length MMLV RT. When R25/D25 was incubated with
DC1 or DC2, various bands (mainly 7–16-nt bands) were only
detected at a 10 lM and 10 min. Under all othe

Kết quả (Việt) 1:

Để lọc WT, DC1 và DC2, chúng tôi sử dụng sắc ký trao đổi anion là bước đầu tiên, Ni2 +-sắc kí SepharoseBước thứ hai, và sắc ký ái lực Strep-TactinBước thứ ba. Tại mỗi bước, mỗi phần được thử nghiệm cho cácsự hiện diện của 25-kDa hoặc 24-kDa protein band bởi SDS-trang,và các phần phân đoạn của hoạt động đã được gộp lại dựa trên coomassie nhuộm.Dùng mũi SDS-trang phân tích đã chỉ ra rằng các phần phân đoạn của hoạt động từ cácThanh lọc WT trưng bày 25-kDa protein bands (hình 2A), vàCác chế phẩm tinh khiết WT, DC1 và DC2 trưng bày 25-kDahoặc 24-kDa protein bands (hình 2B). Trong hình 2B, 50 hoặc 55 kDa mờ nhạtBan nhạc cũng được quan sát; Tuy nhiên, nguồn gốc của họ đã không biết.Sau đó, N-terminal strep thẻ và thiết bị đầu cuối C (của mình) từ khóa 10 đãgỡ bỏ liên tiếp proteolysis với HRV 3 C protease vàthrombin, tương ứng. Sau khi proteolysis, chuẩn bị WTtrưng bày một đơn 22-kDa protein ban nhạc (hình 2 c), DC1 vàDC2 chuẩn bị triển lãm duy nhất 21-kDa protein bands (dữ liệukhông hiển thị), và các ban nhạc protein tương ứng với 50 hoặc55 kDa mờ nhạt ban nhạc quan sát thấy trong hình 2B đã không quan sát (hình 2 cWT và dữ liệu không hiển thị cho DC1 và DC2). Từ các nền văn hóa 2 L, 0.5-1.0 mg tinh khiết WT, DC1 và DC2 đã thu được.Trong 20 mM Tris-HCl (pH 7,0), 200 mM NaCl, 2.0 mM DTT, và 10%glycerol, WT, DC1 và DC2 với các thẻ có thể được tập trung để1-2 mg/ml, trong khi không có thẻ, các protein có thể tập trung cho 10 mg/ml (không hiển thị dữ liệu), chỉ ra rằng các loại bỏtrong các thẻ tăng độ hòa tan.Để kiểm tra nếu xoá Ile593-Leu603 hoặc Gly595-Thr605ảnh hưởng đến sự thay đổi về cấu trúc tên miền RNase H bị cô lập, chúng tôi thực hiệnphân tích quang phổ. Quang phổ UV cho thấy rằng tinh khiết WT,DC1, và DC2 trưng bày spectra với một máng sâu lúc khoảng 250 nm và một đỉnh cao tại 275 nm (hình 3B WT và dữ liệukhông hiển thị cho DC1 và DC2). CD phổ đã chỉ ra rằng46 K. Nishimura et al. / biểu hiện Protein và thanh lọc 113 (2015) 44-50tinh khiết WT, DC1 và DC2 tiêu cực ellipticities tại 202-trưng bày250 nm với đỉnh lúc khoảng 208 nm và 222 nm (hình 3BWT và dữ liệu không hiển thị cho DC1 và DC2). Không đángnhững thay đổi đã được quan sát trong UV và CD) spectra, gợi ý rằngDC1, và DC2 không bị từ bất kỳ cấu trúc toàn cầu hoặc quyết liệtthay đổi bởi việc xóa.Đặc tính của các tên miền RNase HĐể phân tích hoạt động RNase H h RNase bị cô lậptên miền, chúng tôi thực hiện dựa trên sự phát huỳnh quang RNase H khảo nghiệm. MộtRNA/ADN lai (gọi là R18/D18) bao gồm một 3 0-fluoresceinlần 18-nt RNA (R18) và một 5 0-dabcyl-sửa đổi 18-nt DNA(D18) được sử dụng làm chất nền (hình 4A). R18/D18 được thiết kế đểphát ra huỳnh quang mạnh khi R18 cảm tại một trang web đóng để3 0 cuối cùng và dán nhãn fluorescein RNA mảnh dissociatestừ ADN bổ sung. Hình 4B cho thấy sự khác biệttrong sự phát huỳnh quang quang phổ của R18/D18 trước và sau phản ứng. Dựa trên báo cáo trước đó, nồng độ MgCl2 làthiết lập ở 5.0 mM [19]. Khi R18/D18 được ủ mà không có cácchiều dài toàn RT hoặc miền RNase H bị cô lập trong 30 phút, cókhông có thay đổi trong các quang phổ huỳnh quang. Là khi R18/D18ủ với 50 nM HIV-1 RT hoặc 1.8 lM WT trong 30 phút, huỳnh quang tăng với đỉnh cao tại 515 nm. Là khi R18/D18ủ với DC1 hoặc DC2 trong 30 phút, không tăng huỳnh quangđược quan sát thấy. Những kết quả này gợi ý rằng WT có hoạt động RNase Hvà DC1 và DC2 không.Để tiếp tục phân tích hoạt động RNase H h RNase bị cô lậptên miền, chúng tôi sử dụng một đồng vị phóng xạ-dựa RNase H khảo nghiệm. MộtRNA/ADN lai (R25/D25) bao gồm một 5 0-[32P]-dán nhãn 25-ntRNA (R25) và một ổ DNA bổ sung (D25) được sử dụngnhư bề mặt (hình 5A). Sau phản ứng RNase H, sản phẩm phản ứng RNA được phân tích bởi denaturing trang. Lần đầu tiên chúng tôi kiểm tra những tác động của MgCl2 tập trung vào các hoạt động RNase Hcủa WT và thấy rằng phản ứng có chứa 0,1-0,2 mM mang lạisố tiền tương đối cao hơn của sản phẩm so với những người có chứa khácnồng độ (0 – 15 mM) (không hiển thị dữ liệu). Vì vậy, là 0,1 mMsử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.Hình 5B cho thấy biến tính trang phân tích sản phẩmthu được từ phản ứng những điều kiện khác nhau. UnreactedR25/D25 cho thấy chỉ một đơn 25-nt RNA ban nhạc. Khi R25/D25được ủ với 30 nM dài MMLV RT, ban nhạc 16-20-ntđược phát hiện tại 15 s, và 14-17-nt ban nhạc đã được phát hiện tại10 phút. Khi R25/D25 được ủ với 30 nM WT, chỉ mộtBan nhạc 25-nt đã được phát hiện ở cả hai 15 s và 10 phút khiR25/D25 được ủ với 1.0 hoặc 10 lM WT, chỉ là một ban nhạc 25-ntđược phát hiện tại 15 s, trong khi các ban nhạc khác nhau (chủ yếu là 7-16-ntBan nhạc) đã được phát hiện lúc 10 phút. Điều này chỉ ra rằng cleavageMô hình của WT được tách biệt nó khỏi MMLV dàiRT và hoạt động của WT đáng kể yếu hơntrong bộ phim dài MMLV RT. Khi R25/D25 được ủ vớiDC1 hay DC2, ban nhạc khác nhau (chủ yếu là ban nhạc 7-16-nt) chỉphát hiện tại một lM 10 và 10 phút. Theo tất cả othe

Kết quả (Việt) 2:

Để làm sạch WT, DC1 và DC2, chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi anion như là bước đầu tiên, Ni2 + sắc ký -Sepharose
như là bước thứ hai, và các mối quan hệ sắc ký Strep-Tactin
như là bước thứ ba. Tại mỗi bước, từng phần đã được thử nghiệm cho
sự hiện diện của 25-kDa hoặc 24-kDa protein ban nhạc bằng SDS-PAGE,
và các phần phân đoạn của hoạt động được tập hợp dựa trên coomassie nhuộm.
Các phân tích SDS-PAGE cho thấy các phân số hoạt động từ
WT lọc trưng bày 25-kDa băng protein (Hình. 2A), và
các chế phẩm tinh khiết của WT, DC1, DC2 và trưng bày 25-kDa
hoặc 24-kDa băng protein (Hình. 2B). Trong hình. 2B, 50 hoặc 55 kDa mờ nhạt
ban nhạc cũng đã được quan sát; Tuy nhiên nguồn gốc của họ là không biết.
Sau đó, thẻ strep N-terminal và C-terminal 10 thẻ (của ông) đã được
loại bỏ bởi sự phân giải protein tiếp với HRV 3C protease và
thrombin, tương ứng. Sau khi phân giải protein, việc chuẩn bị WT
trưng bày một băng protein 22 kDa đơn (Hình. 2C), các DC1 và
chuẩn bị DC2 trưng bày giới 21-kDa băng protein (dữ liệu
không hiển thị), và các ban nhạc protein tương ứng với 50 hoặc
55 kDa mờ nhạt băng quan sát trong hình. 2B đã không quan sát (Hình. 2C
cho WT và dữ liệu không được hiển thị cho DC1 và DC2). Từ 2 nền văn hóa L, 0,5-1,0 mg tinh khiết WT, DC1, DC2 và đã thu được.
Trong 20 mM Tris-HCl (pH 7.0), 200 mM NaCl, 2,0 mM DTT, và 10%
glycerol, WT, DC1, và DC2 với các thẻ có thể được tập trung vào
1-2 mg / ml, trong khi không có thẻ, các protein này có thể được tập trung đến 10 mg / ml (dữ liệu không hiển thị), chỉ ra rằng việc loại bỏ
các thẻ tăng độ hòa tan.
để kiểm tra nếu việc xóa của Ile593-Leu603 hoặc Gly595-Thr605
ảnh hưởng đến sự thay đổi cấu trúc của miền RNase H bị cô lập, chúng tôi đã
phân tích quang phổ. UV quang phổ cho thấy tinh khiết WT,
DC1, DC2 và trưng bày phổ với đáy sâu vào khoảng 250 nm và một đỉnh cao ở 275 nm (Hình. 3B cho WT và dữ liệu
không được hiển thị cho DC1 và DC2). CD quang phổ cho thấy rằng
46 K. Nishimura et al. / Protein biểu hiện và lọc 113 (2015) 44-50
tịnh WT, DC1, DC2 và trưng bày ellipticities tiêu cực tại 202-
250 nm với đỉnh ở khoảng 208 nm và 222 nm (Hình. 3B
cho WT và dữ liệu không được hiển thị cho DC1 và DC2 ). Không đáng kể
thay đổi đã được quan sát thấy trong tia cực tím và CD) phổ, cho thấy rằng
DC1 và DC2 không bị bất kỳ cấu trúc toàn cầu hay quyết liệt
thay đổi bởi việc xóa.
Đặc tính của miền RNase H
Để phân tích các hoạt động RNase H của RNase H bị cô lập
các miền , chúng tôi thực hiện huỳnh quang dựa trên RNase H khảo nghiệm. Một
lai RNA / DNA (gọi là R18 / D18) bao gồm một 3 0-fluorescein
sửa đổi 18-nt RNA (R18) và 5 0-dabcyl biến đổi 18-nt DNA
(D18) đã được sử dụng như là chất nền (Hình. 4A ). R18 / D18 được thiết kế để
phát ra huỳnh quang mạnh khi R18 được cắt tại một trang web gần
cuối 3 0, và các đoạn RNA fluorescein-dán nhãn phân ly
từ các sợi DNA bổ sung. Sung. 4B cho thấy sự khác biệt
trong phổ huỳnh quang của R18 / D18 trước và sau phản ứng. Dựa trên các báo cáo trước đó, nồng độ MgCl2 được
đặt ở 5,0 mM [19]. Khi R18 / D18 được ủ mà không có
độ dài đầy đủ RT hoặc miền RNase H bị cô lập trong 30 phút, có
là không có sự thay đổi trong quang phổ huỳnh quang. Khi R18 / D18 đã được
ủ với 50 nM HIV-1 RT hoặc 1,8 lm WT trong 30 phút, huỳnh quang tăng lên với mức đỉnh 515 nm. Khi R18 / D18 đã được
ủ với DC1 hoặc DC2 trong 30 phút, không tăng huỳnh quang
đã được quan sát. Những kết quả này gợi ý rằng WT có hoạt tính RNase H
và DC1 và DC2 không.
Để tiếp tục phân tích các hoạt động RNase H của RNase H bị cô lập
các lĩnh vực, chúng tôi sử dụng một đồng vị phóng xạ dựa trên RNase H khảo nghiệm. Một
RNA / DNA lai (R25 / D25) gồm 5 0- [32P] -labeled 25-nt
RNA (R25) và DNA bổ sung không có nhãn (D25) đã được sử dụng
như là chất nền (Hình. 5A). Sau khi phản ứng RNase H, các sản phẩm phản ứng RNA được phân tích bằng cách biến tính TRANG. Đầu tiên chúng ta kiểm tra ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 vào hoạt động RNase H
của WT và thấy rằng phản ứng có chứa 0,1-0,2 mM mang lại
số tiền tương đối cao hơn các sản phẩm so với những người khác có chứa
nồng độ (0-15 mM) (dữ liệu không hiển thị). Do đó, 0,1 mM
sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
Hình. 5B cho thấy các phân tích TRANG biến tính của các sản phẩm
thu được từ phản ứng trong điều kiện khác nhau. Không phản ứng
R25 / D25 cho thấy chỉ có một ban nhạc RNA 25-nt duy nhất. Khi R25 / D25
đã được ủ với 30 nM full-length MMLV RT, các ban nhạc 16-20-nt
đã được phát hiện tại 15 s, và ban nhạc 14-17-nt đã được phát hiện ở
10 phút. Khi R25 / D25 đã được ủ với 30 nM WT, chỉ có một
ban nhạc 25-nt đã được phát hiện ở cả 15 s và 10 phút. Khi
R25 / D25 được ủ với 1,0 hoặc 10 LM WT, chỉ có một ban nhạc 25-nt
đã được phát hiện tại 15 s, trong khi ban nhạc khác nhau (chủ yếu là 7-16-nt
ban nhạc) đã được phát hiện ở 10 phút. Điều này chỉ ra rằng sự phân tách
mô hình của WT là khác nhau từ đó của độ dài đầy đủ MMLV
RT và rằng hoạt động của WT yếu hơn đáng kể so với
các độ dài đầy đủ MMLV RT. Khi R25 / D25 đã được ủ với
DC1 hoặc DC2, các ban nhạc khác nhau (chủ yếu là ban nhạc 7-16-nt) chỉ được
phát hiện ở 10 LM và 10 phút. Theo bài Tin liên quan