2. Technical aspectsDGGE is an elec

2. Technical aspects
DGGE is an electrophoretic method capable of detecting differences between DNA fragments of the same size but with different sequences. This is because these fragments can be separated in a denaturing gradient gel based on their differential denaturation (melting) profile. The theoretical aspects of this separation were firstly described by Fisher and Lerman (1983). In an acrylamide gel, the denaturing conditions are provided by urea and formamide. A solution of 100% chemical denaturant consists of 7 M urea and 40% formamide in water. Low and high denaturing solutions are prepared, mixed with the acrylamide solution, and poured in a gel casting by using a gradient former in order to generate a linear denaturing gradient. Moreover, the electrophoresis is carried out at a constant temperature between 55 and 65 jC, mostly 60 jC. In a DGGE gel, double-strand DNA fragments are subjected to an increasing denaturing environment as they encounter increasing concentrations of the denaturing agents and partially melt in discrete regions called ‘‘melting domains.’’ The melting temperature (Tm) of these domains is sequence-specific. Once the Tm of the lowest melting domain is reached, that part of the fragment becomes partially melted, creating branched ‘‘breaking’’ molecules. This behaviour reduces the DNA mobility in the acrylamide gel. Therefore, DNA fragments of the same size but different base pair compositions will show a different response to the denaturing gradient. The different sequences of the DNA fragments will have melting domains with different Tm values that will run different distances in the DGGE gel. Briefly, DNA fragments of the same length but different sequences will be separated in DGGE. DGGE can be performed in either perpendicular or parallel denaturing gradient gels. In perpendicular gradient gels, the denaturing gradient is perpendicular to the direction of the electrophoresis and the gradient range is usually broad such as 0–100% or 20–100%; they are commonly used to detect the melting behaviour of DNA fragments and to experimentally determine the optimal denaturing range to use in parallel
electrophoresis experiments. In perpendicular gradient gels, only one sample can be loaded or a mixture of amplicons for which the melting behaviour is to be studied. In parallel DGGE, the denaturing gradient is parallel to the electric field and the range of denaturants is narrowed, allowing a better separation (Myers et al., 1987). The parallel gels are the most commonly employed as they allow multiple samples to be loaded on the same gel. The optimal time of

Kết quả (Việt) 1:

2. kỹ thuậtDGGE là một phương pháp electrophoretic khả năng phát hiện sự khác biệt giữa DNA mảnh vỡ của kích thước tương tự nhưng với trình tự khác nhau. Điều này là bởi vì các mảnh vỡ có thể được tách ra thành một gel gradient denaturing dựa trên tiểu sử của họ khác biệt giữa denaturation (nóng chảy). Lý thuyết các khía cạnh của ly thân này thứ nhất được mô tả bởi Fisher và Lerman (1983). Trong một gel acrylamide, các điều kiện denaturing được cung cấp bởi urê và formamide. Một giải pháp hóa học 100% denaturant bao gồm formamide 7 M urê và 40% trong nước. Thấp và cao biến tính giải pháp được chuẩn bị, trộn lẫn với các giải pháp acrylamide, và đổ vào một gel đúc bằng cách sử dụng một cựu gradient để tạo ra một gradient denaturing tuyến tính. Hơn nữa, điện được thực hiện tại một nhiệt độ không đổi giữa 55 và 65 jC, chủ yếu là 60 jC. Trong một gel DGGE, đôi sợi DNA mảnh là đối tượng cho một môi trường ngày càng tăng của denaturing khi họ gặp phải các nồng độ ngày càng tăng của các đại lý denaturing và một phần làm tan chảy ở rời rạc vùng này được gọi là '' tên miền có chảy ''. Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của những tên miền là trình tự cụ thể. Khi Tm vùng nóng chảy thấp nhất đạt đến, rằng một phần của đoạn sẽ trở thành một phần biến, việc tạo ra nhánh '' phá vỡ '' phân tử. Hành vi này làm giảm tính di động DNA trong acrylamide gel. Do đó, ADN mảnh vỡ của các kích thước tương tự nhưng khác nhau căn cứ cặp tác phẩm sẽ hiển thị một phản ứng khác nhau cho các biến tính gradient. Trình tự DNA mảnh khác nhau sẽ có nóng chảy các tên miền với giá trị Tm khác nhau sẽ chạy khoảng cách khác nhau trong DGGE gel. Một thời gian ngắn, những mảnh ADN chiều dài tương tự nhưng khác nhau trình tự sẽ được tách ra trong DGGE. DGGE có thể được thực hiện trong vuông góc hoặc song song biến tính gradient gel. Trong vuông góc gradient gel, denaturing gradient là vuông góc với hướng điện và dãy gradient là thường rộng như 0-100% hoặc 20-100%; họ thường được sử dụng để phát hiện hành vi nóng chảy của các mảnh vỡ DNA và thử nghiệm xác định phạm vi denaturing tối ưu để sử dụng song songthí nghiệm điện. Trong vuông góc gradient gel, chỉ có một mẫu có thể được nạp hoặc một hỗn hợp của amplicons mà hành vi nóng chảy là để được nghiên cứu. Ở song song DGGE, denaturing gradient là song song với điện trường và phạm vi của denaturants thu hẹp, cho phép một tách tốt hơn (Myers và ctv., 1987). Gel song song phổ biến nhất được sử dụng vì chúng cho phép nhiều mẫu phải thực hiện trên cùng một gel. Thời gian tối ưu của

Kết quả (Việt) 2:

2. Khía cạnh kỹ thuật
DGGE là một phương pháp điện di khả năng phát hiện sự khác biệt giữa các mảnh vỡ DNA có kích thước tương tự nhưng với trình tự khác nhau. Điều này là do các mảnh vỡ có thể được tách ra trong một gel biến tính Gradient dựa trên sự biến tính khác biệt của họ (nóng chảy) profile. Các khía cạnh lý thuyết của sự tách biệt này đã được mô tả đầu tiên bởi Fisher và Lerman (1983). Trong một gel acrylamide, các điều kiện làm biến tính được cung cấp bởi urê và formamid. Một giải pháp 100% biến tính hóa học gồm 7 M urea và 40% formamid trong nước. Giải pháp biến tính thấp và cao được chuẩn bị, trộn với các giải pháp acrylamide, và đổ vào một casting gel bằng cách sử dụng một cựu Gradient để tạo ra một gradient tuyến tính biến tính. Hơn nữa, khi điện được thực hiện ở một nhiệt độ ổn định từ 55 đến 65 JC, chủ yếu là 60 JC. Trong một gel DGGE, các mảnh DNA đôi sợi đang phải chịu một môi trường làm biến tính tăng lên khi họ gặp phải gia tăng nồng độ của các tác nhân biến tính và phần tan trong khu vực riêng được gọi là '' các lĩnh vực nóng chảy. '' Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các lĩnh vực này là trình tự cụ thể. Khi Tm của miền nhiệt độ nóng chảy thấp nhất đạt được, đó là một phần của đoạn bị tan chảy một phần, tạo ra các phân nhánh '' phá vỡ 'phân tử ". Hành vi này làm giảm sự di chuyển DNA trong gel acrylamide. Do đó, các mảnh DNA có cùng kích thước nhưng tác phẩm cặp base khác nhau sẽ cho thấy một phản ứng khác nhau để gradient biến tính. Các trình tự khác nhau của các đoạn DNA sẽ có lĩnh vực nóng chảy với các giá trị khác nhau Tm mà sẽ chạy khoảng cách khác nhau trong gel DGGE. Tóm lại, các mảnh DNA có cùng chiều dài nhưng trình tự khác nhau sẽ được tách trong DGGE. DGGE có thể được thực hiện trong hoặc gel biến tính Gradient vuông góc hoặc song song. Trong gel Gradient vuông góc, gradient biến tính là vuông góc với hướng của điện và chênh lệch khoảng thường rộng như 0-100% hoặc 20-100%; chúng thường được sử dụng để phát hiện các hành vi nóng chảy các mảnh DNA và thực nghiệm xác định phạm vi biến tính tối ưu để sử dụng song song
các thí nghiệm điện. Trong gel Gradient vuông góc, chỉ có một mẫu có thể được nạp hoặc một hỗn hợp của amplicon mà các hành vi nóng chảy là được nghiên cứu. Song song DGGE, gradient biến tính song song với điện trường và phạm vi của các chất làm biến tính được thu hẹp, cho phép một tách tốt hơn (Myers et al., 1987). Các gel song song được phổ biến nhất được sử dụng vì chúng cho phép nhiều mẫu được nạp trên gel cùng. Thời gian tối ưu của