To date, no follow-up publication d

To date, no follow-up publication describing mutant phenotypes appeared.
656 J Mol Med (2010) 88:653–664
Retinitis pigmentosa (RP) typically causes night blindness early in life due to loss of rod photoreceptors. The remaining cone photoreceptors slowly degenerate leading ultimately to blindness. Various genes and loci are associated with the
disease. Both transgenic and knockout rodent models of retinal dystrophy contributed to the analysis of the disease. Compared to humans, rodent models are limited by two disadvantages, the small number and different distribution of
neopromoter coding sequence Expressing transgenic pigs
Selectable expression vector
Transfection
Selection Embryo transfer
Nuclear transfer I
Nuclear transfer II
Establishment of cell culturesEmbryo transfer
Fetuses or offspring
Screening (integration, expression)
Fig. 2 Efficient production of transgenic pigs by using somatic cell nuclear transfer. An expression vector carrying a removable selection cassette is transfected into nuclear donor cells. After selection, the resulting transgenic cells are pooled and used for nuclear transfer. Pooling of cell colonies reduces the time in culture and allows the generation of independent founder fetuses/offspring in one litter. Cloned embryos are transferred to synchronized recipients. Depending
on the expected onset and tissue specificity of transgene expression, pregnancies may be terminated to recover fetuses, or birth and early development of offspring is awaited. Fetuses or tissues from born offspring are processed for transgene integration and expression studies, while individual cell cultures are established for re-cloning of the fetuses/offspring with the most suitable integration/expression pattern
Table 1 Transgenic pigs as disease models
Human disease Transgene expression References
Alzheimer’s disease Expression of mutant human APPsw in the brain Kragh PM et al. 2009 [32] Huntington’s disease Transgenic animals with mutant pig HTT Uchida M et al. 2001 [34] Retinitis pigmentosa Retinal expression of mutant pig RHOP347L or RHOP347S Petters RM et al. 1997, Kraft TW et al. 2005 [36, 37] Cardiovascular disease Endothelial over-expression of pig eNOS Hao YH et al. 2006 [40] Cystic fibrosis CFTR knockout or mutant pig CFTRdeltaF508 knockin Rogers CS et al. 2008 [28, 44] Type 2 diabetes mellitus Beta-cell expression of mutant dominant-negative human GIPRdn Renner S et al. 2010 [56] Type 3 of maturity-onset diabetes of the young Beta-cell expression of mutant dominant-negative human HNF1AP291fsinsC Umeyama K et al. 2009 [59]
J Mol Med (2010) 88:653–664 657
photoreceptors in the retina and the small eyes [35]. Therefore, transgenic pigs expressing a mutant porcine rhodopsin (RHO; P347L or P347S) were produced by additive gene transfer. A 12.5-kb porcine genomic DNA containing 4-kb 5′ flanking sequences, the coding sequences for the 348 amino acid protein and 2.9-kb 3′ flanking sequences of the porcine RHO gene was used for the introductionofthemutationCCA(Pro)→CTA(Leu)orTCA (Ser) in codon 347. DNA microinjection of the expression vectors for mutant rhodopsin resulted in the generation of transgenic lines. Retinal RNA expression of the mutant transgene exceeded the expression of the wild-type endogenous gene. Like human patients with the same mutation, the transgenic pigs showed early and severe loss of rod photoreceptors, and the surviving cone photoreceptors slowly degenerated. The phenotypes of mutant RHO transgenic pigs and of RP patients are comparable. Therefore, this novel animal model is intensely used for studying the pathogenesis of retinitis pigmentosa as well as for preclinical treatment trials [36, 37]. Furthermore, production of a transgenic pig model for spinal muscular atrophy, an autosomal recessive disorder characterized by the degeneration of motor neurons of the spinal cord leading to muscle atrophy, has been announced [38].
Cardiovascular diseases
Endothelial cell nitric oxide synthase (eNOS) regulates vascular function by releasing nitric oxide [39]. Transgenic pigs were produced for the analysis of the cardiovascular regulation by eNOS. The 7.3 kb transgene consisted of the 3.6-kb Yucatan pig eNOS cDNA and a V5 epitope and polyhistidine tag (V5-His tag) to discriminate between endogenous and transgenic eNOS that was cloned between the 2-kb TIE2 promoter and 1.7-kb TIE2 intron/enhancer elements for the endothelial cell-specific expression. The transgene was used for co-electroporation with a neomycin resistance gene expression cassette into Yucatan pig fetal fibroblasts for additive gene transfer. Four cloned transgenic pigs derived by SCNTof transgene-positive cells expressed the fusion protein which was localized to the endothelial cells of placental vasculature from the conceptuses as did the endogenous eNOS. The predicted size of the recombinant eNOS (1,242 amino acids) was 138 kDa, compared to 133 kDa of endogenous eNOS (1,205 amino acids). Localization of endogenous and transgenic eNOS revealed the expression in the endothelium. The transgenic pigs are further used to analyze the function of eNOS in regulating muscle metabolism and in the cardiorespiratory system [40]. In addition, a complementary knockout model of eNOS has been announced [41].
Cystic fibrosis
Alterations of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (1,480 amino acids) were identified to cause the autosomal recessive cystic fibrosis which still remains incurable. Mice with a disrupted Cftr gene failed to develop the lung and pancreatic disease causing most of the morbidity and mortality in human patients [42]. Porcine lungs share many anatomical, histological, biochemical, and physiological features with human lungs [43]. Mutant pigs were produced using SCNT and fetal fibroblasts with the CFTR gene either disrupted or containing the most common cystic fibrosis-associated mutation (deltaF508). Therefore, recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors were used to target CFTR in male fetal fibroblasts ofoutbreddomesticpigs.The4.5-kbknockoutgeneconstruct disrupted exon 10 encoding a portion of nucleotide-binding domain1withastopcodonatposition508(F508X)followed by a floxed neomycin resistance gene driven by the phosphoglycerate kinase (PGK) promoter, whereas the deltaF508 knockin gene construct harbors the three nt deletion in exon 10 leading to deltaF508 followed by a floxed neomycin resistance gene driven by the PGK promoter in the downstream intronic region. Using successfully targeted cells without viral vector sequences for SCNT, heterozygous mutant male piglets were generated with each mutation [28, 44]. Newborn piglets with a targeted disruption of both CFTR alleles exhibited similar defects as seen in newborn human patients, i.e., meconium ileus, exocrine pancreatic destruction, and focal biliary cirrhosis. Thus, the novel disease models may improve the analysis of the pathogenesis as well as the development of treatment strategies for cystic fibrosis [28, 44]. In addition, preliminary conference reports announced the production of transgenic pigs for the suppression of CFTR expression by RNA interference.
Diabetes mellitus
Rodent models for diabetes mellitus have been developed by the structural and/or functional modification of candidate genes [45] or by random mutagenesis programs [46]. Transgenic pigs were recently established as large animal models. In the context of type 2 diabetes mellitus, a chronic metabolic disorder of multiple etiologies characterized by uncontrolled hyperglycemia caused by both insulin resistance and progressive pancreatic beta-cell dysfunction [47], the two incretin hormones glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP) and glucagon-like peptide-1 (GLP-1) attracted particular attention. GIP and GLP-1 are secreted by enteroendocrine cells in response to nutrients like fat and glucose and enhance glucose-induced insulin secretion [48]. In type 2 diabetic patients, the insulinotropic action of GIP is
658 J Mol Med (2010) 88:653–664
highly impaired [49]. Nearly sustained insulinotropic action of GLP-1 in type 2 diabetic patients revealed its therapeutic potential to compensate for the loss of GIP function and initiated the development of incretin-based therapeutics [50]. The reasons for the reduced response to GIP in type 2 diabetes are unclear, but it was suggested that impaired GIP action might be involved in the early pathogenesis of type 2 diabetes mellitus [51]. Recently, a meta-analysis of nine genome-wide association studies in humans revealed that variation in the GIP-receptor (GIPR) gene influences the glucose and insulin responses to an oral glucose challenge [52]. To clarify the role of the GIP/GIPR axis, a mouse model lacking expression of a functional GIPR was generated by gene targeting [53]. Gipr−/− mice displayed only slightly impaired glucose tolerance and did not develop diabetes mellitus. Compensatory regulation of the GLP-1 system or other compensatory mechanisms were discussed as possible explanations for this relatively mild phenotype (reviewed in [54]). In contrast, two independent lines of transgenic mice overexpressing a dominant-negative GIPR (GIPRdn) under the control of the rat Ins2 promoter (RIP II) in the pancreatic islets displayed early-onset diabetes mellitus and loss of beta-cells associated with extensive structural alterations of the pancreatic islets [55]. However, it could not be excluded that the severe phenotype observed in the pancreatic islets of this model was due to effects other than impaired GIPR signaling (e.g., squelching of G-proteins, hence impairment/inhibition of other signaling pathways). To address the question of whether GIPR signaling plays a role in maintaining pancreatic islet function and structure, a large animal model has been generated [56]. Efficient lentiviral vectors were used to generate transgenic pigs expressing a GIPRdn under the control of the rat Ins2 promoter in the pancr

Kết quả (Việt) 1:

Đến nay, không có xuất bản tiếp theo mô tả đột biến phenotypes xuất hiện.656 J Mol Med (2010) 88:653-664Retinitis pigmentosa (RP) thường gây ra đêm mù sớm trong cuộc sống do mất của rod photoreceptors. Nón photoreceptors còn lại từ từ làm suy thoái dẫn cuối cùng đến mù. Các gen khác nhau và các loci có liên kết với cácbệnh. Cả hai biến đổi gen và loại trực tiếp các mô hình động vật gặm nhấm võng mạc loạn dưỡng đã đóng góp cho các phân tích của bệnh. So với con người, động vật gặm nhấm mô hình được giới hạn bởi hai nhược điểm, số lượng nhỏ và phân bố khác nhauneopromoter mã hóa trình tự Expressing biến đổi gen lợnLựa chọn biểu hiện vectorTransfectionLựa chọn chuyển phôiHạt nhân chuyển tôiHạt nhân chuyển IIThành lập các tế bào culturesEmbryo chuyểnBào thai hoặc con cáiKiểm tra (tích hợp, biểu hiện)Hình 2 hiệu quả sản xuất của các con lợn biến đổi gen bằng cách sử dụng chuyển giao hạt nhân tế bào Soma. Một véc tơ biểu hiện mang theo một cassette ổ lựa chọn transfected vào các nhà tài trợ hạt nhân tế bào. Sau khi lựa chọn, các tế bào kết quả biến đổi gen được gộp lại và được sử dụng để chuyển giao hạt nhân. Tổng hợp của thuộc địa di động làm giảm thời gian trong văn hóa và cho phép các thế hệ của người sáng lập ra độc lập bào thai/con cái trong một xả rác. Nhân bản phôi được chuyển giao cho người nhận được đồng bộ hóa. Tùy thuộcngày dự kiến khởi phát và mô đặc trưng của transgene biểu hiện, mang thai có thể được chấm dứt để phục hồi bào thai hoặc sinh và giai đoạn phát triển của con cái chờ đợi. Bào thai hoặc mô từ con cái sinh được thực hiện cho transgene tích hợp và biểu hiện nghiên cứu, trong khi nền văn hóa cá nhân tế bào được thành lập cho tái nhân bản của bào thai/con cái với các mô hình tích hợp/cụm từ thích hợp nhấtBảng 1 biến đổi gen con lợn là mô hình bệnhNgười bệnh Transgene biểu hiện tài liệu tham khảoBiểu hiện của bệnh Alzheimer của đột biến con người APPsw trong não Kragh PM et al. năm 2009 [32] Huntington bệnh động vật biến đổi gen với đột biến lợn HTT Uchida M et al. năm 2001 [34] Retinitis pigmentosa võng mạc biểu hiện của đột biến lợn RHOP347L hoặc RHOP347S Petters RM et al. 1997, Kraft TW et al. 2005 [36, 37] bệnh tim mạch nội mô hơn-biểu hiện của lợn eNOS Hao YH et al. 2006 [40] xơ nang CFTR loại trực tiếp hoặc đột biến lợn CFTRdeltaF508 knockin Rogers CS et al. 2008 [28 44] loại 2 bệnh tiểu đường tế bào Beta biểu hiện của đột biến âm chiếm ưu thế của con người GIPRdn Renner S et al. 2010 [56] loại 3 bệnh tiểu đường khởi đầu sự trưởng thành của biểu thức tế bào Beta trẻ của đột biến âm chiếm ưu thế của con người HNF1AP291fsinsC Umeyama K et al. 2009 [59]J Mol Med (2010) 88:653-664 657photoreceptors trong võng mạc và đôi mắt nhỏ [35]. Do đó, biến đổi gen con lợn thể hiện một đột biến rhodopsin porcine (RHO; P347L hoặc P347S) được sản xuất bởi phụ gia gen chuyển. Một 12,5-kb porcine gen DNA có 5 ' 4-kb sườn trình tự, các trình tự mã hóa cho các axit amin protein 348 và 3 ' 2,9-kb sườn trình tự của porcine RHO gene được sử dụng cho introductionofthemutationCCA (Pro) →CTA (Leu) orTCA (Ser) ở codon 347. DNA microinjection của vectơ biểu hiện cho đột biến rhodopsin kết quả trong thế hệ của biến đổi gen dòng. Võng mạc RNA biểu hiện của đột biến transgene vượt quá sự biểu hiện của gen nội sinh loại hoang. Giống như các bệnh nhân của con người với cùng một đột biến, cho thấy những con lợn biến đổi gen đầu và nghiêm trọng mất que photoreceptors, và nón photoreceptors còn sống sót từ từ thoái hóa. Phenotypes của đột biến RHO biến đổi gen lợn và bệnh nhân RP được so sánh. Do đó, mô hình động vật cuốn tiểu thuyết này mạnh mẽ được sử dụng để nghiên cứu bệnh sinh của retinitis pigmentosa là tốt đối với thử nghiệm preclinical điều trị [36, 37]. Hơn nữa, sản xuất của một mô hình biến đổi gen lợn cho cột sống cơ bắp Teo, một rối loạn lặn NST thường đặc trưng bởi sự thoái hóa tế bào thần kinh cơ của tủy dẫn đến cơ Teo, đã là công bố [38].Bệnh tim mạchTế bào nội mô nitric oxide synthase (eNOS) quy định chức năng mạch máu bằng cách giải phóng nitric oxide [39]. Lợn biến đổi gen đã được sản xuất cho các phân tích của các quy định tim mạch eNOS. 7.3 kb transgene bao gồm 3,6-kb Yucatan lợn eNOS cDNA và một V5 epitope và polyhistidine thẻ (V5 His thẻ) để phân biệt đối xử giữa eNOS nội sinh và biến đổi gen đã được nhân bản giữa 2-kb TIE2 promoter và 1,7-kb TIE2 intron/enhancer yếu tố cho các biểu hiện cụ thể tế bào nội mô. Transgene được sử dụng co-electroporation với một sức đề kháng neomycin biểu hiện gen cassette vào Yucatan lợn thai fibroblasts cho phụ gia gen chuyển. Bốn con lợn biến đổi gen nhân bản của SCNTof transgene-tích cực tế bào thể hiện phản ứng tổng hợp protein mà được bản địa hoá đến các tế bào nội mô của nhau thai mạch máu từ các conceptuses như đã làm eNOS nội sinh. Cỡ tái tổ hợp eNOS (1.242 axit amin), dự đoán là kDa 138, so với 133 kDa nội sinh eNOS (1.205 axit amin). Bản địa hóa nội sinh và biến đổi gen eNOS tiết lộ những biểu hiện trong nội mạc. Những con lợn biến đổi gen tiếp tục được sử dụng để phân tích các chức năng của eNOS trong việc điều chỉnh sự trao đổi chất cơ bắp và trong hệ thống cardiorespiratory [40]. Ngoài ra, một mô hình bổ sung vòng đấu loại trực của eNOS đã là công bố [41].Xơ nangCác thay đổi của điều xuyên dẫn xơ nang (1.480 axit amin) đã được xác định để gây ra bệnh xơ nang lặn NST thường mà vẫn không thể chữa khỏi. Con chuột với một gen Cftr gián đoạn thất bại trong việc phát triển các phổi và tuyến tụy bệnh gây ra hầu hết các tỷ lệ mắc và tử vong ở những bệnh nhân của con người [42]. Porcine phổi chia sẻ nhiều tính năng giải phẫu, mô học, hóa sinh và sinh lý với con người phổi [43]. Đột biến con lợn đã được sản xuất bằng cách sử dụng SCNT và fibroblasts thai nhi bằng gen CFTR bị gián đoạn hoặc có chứa phổ biến nhất liên quan đến bệnh xơ nang đột biến (deltaF508). Vì vậy, vectơ tái tổ hợp liên quan đến ADO virus (rAAV) đã được sử dụng để nhắm mục tiêu CFTR ở Nam thai fibroblasts ofoutbreddomesticpigs. The4.5-kbknockoutgeneconstruct gián đoạn exon 10 mã hóa một phần nucleotide-ràng buộc domain1withastopcodonatposition508 (F508X) theo sau bởi một floxed neomycin kháng gen lái xe của promoter kinase (PGK) photphoglyxerat, trong khi xây dựng gen knockin deltaF508 cảng xóa nt ba trong exon 10 hàng đầu để deltaF508 theo sau là một floxed neomycin kháng gen lái xe của promoter PGK intronic vùng hạ lưu. Sử dụng các tế bào được nhắm mục tiêu thành công mà không có virus vector chuỗi cho SCNT, hổ heo con đột biến tỷ đã được tạo ra với mỗi đột biến [28, 44]. Các heo con sơ sinh với một sự phá vỡ được nhắm mục tiêu của cả hai allele CFTR trưng bày lỗi tương tự như nhìn thấy ở trẻ sơ sinh bệnh nhân của con người, tức là, meconium ileus, phá hủy tuyến tụy ngoại tiết và đầu mối biliary xơ gan. Vì vậy, các mô hình bệnh tiểu thuyết có thể cải thiện các phân tích của bệnh sinh cũng như sự phát triển của chiến lược điều trị cho bệnh xơ nang [28, 44]. Ngoài ra, báo cáo sơ bộ hội nghị công bố sản xuất biến đổi gen con lợn đàn áp CFTR biểu hiện của sự can thiệp của RNA.Bệnh tiểu đườngCác mô hình động vật gặm nhấm cho bệnh tiểu đường đã được phát triển bởi các sửa đổi cấu trúc và/hoặc chức năng của các ứng cử viên gen [45] hoặc bởi chương trình ngẫu nhiên mutagenesis [46]. Biến đổi gen con lợn mới được thành lập như là mô hình động vật lớn. Trong bối cảnh của loại 2 bệnh tiểu đường, một rối loạn trao đổi chất mãn tính của nhiều etiologies đặc trưng bởi tăng đường huyết không kiểm soát được gây ra bởi kháng insulin và tiến bộ tuyến tụy tế bào beta rối loạn chức năng [47], hai incretin kích thích tố phụ thuộc vào đường insulinotropic polypeptide (GIP) và glucagon như peptide-1 (GLP-1) thu hút sự chú ý đặc biệt. GIP và GLP-1 được bài tiết bởi các tế bào enteroendocrine để đáp ứng với chất dinh dưỡng như chất béo và glucose và tăng cường sự tiết insulin glucose gây ra [48]. Ở bệnh nhân tiểu đường loại 2, hành động insulinotropic của GIP là658 J Mol Med (2010) 88:653-664đánh giá cao impaired [49]. Hành động gần như duy trì insulinotropic của GLP-1 ở bệnh nhân tiểu đường loại 2 cho thấy tiềm năng điều trị của nó để bù đắp cho mất chức năng GIP và khởi xướng sự phát triển của incretin dựa trên trị liệu [50]. Những lý do cho các phản ứng giảm để GIP trong tiểu đường loại 2 không rõ ràng, nhưng nó đã được đề xuất rằng suy GIP hành động có thể được tham gia vào bệnh sinh đầu của loại 2 bệnh tiểu đường [51]. Gần đây, một meta-phân tích chín toàn bộ gen Hiệp hội nghiên cứu ở người cho thấy rằng biến đổi gen GIP-thụ thể (GIPR) ảnh hưởng đến các phản ứng glucose và insulin để một thách thức uống glucose [52]. Để làm rõ vai trò của các trục GIP/GIPR, một mô hình chuột thiếu các biểu hiện của một GIPR chức năng đã được tạo ra bởi gen nhắm mục tiêu [53]. Gipr−/− chuột Hiển thị chỉ hơi suy dung nạp glucose và không phát triển bệnh tiểu đường. Đền bù quy định của hệ thống GLP-1 hoặc các cơ chế đền bù khác đã được thảo luận là có thể giải thích cho này kiểu hình tương đối nhẹ (xem xét trong [54]). Ngược lại, hai dòng độc lập của biến đổi gen chuột kết một chi phối âm GIPR (GIPRdn) thuộc thẩm quyền của chuột Ins2 promoter (RIP II) trong tuyến tụy đảo Hiển thị sớm khởi phát bệnh tiểu đường và mất mát của các tế bào beta liên kết với rộng rãi thay đổi cấu trúc của tuyến tụy đảo [55]. Tuy nhiên, nó có thể không được loại trừ các kiểu hình nghiêm trọng quan sát thấy ở đảo tuyến tụy của mô hình này là do các hiệu ứng khác hơn là suy GIPR tín hiệu (ví dụ như, squelching G-protein, vì thế suy/ức chế con đường tín hiệu khác). Để giải quyết các câu hỏi về cho dù GIPR tín hiệu đóng một vai trò trong việc duy trì chức năng tuyến tụy đảo và cấu trúc, một mô hình động vật lớn đã là tạo ra [56]. Hiệu quả lentiviral vector được sử dụng để tạo ra các biến đổi gen con lợn thể hiện một GIPRdn dưới sự kiểm soát của promoter Ins2 chuột trong pancr

Kết quả (Việt) 2:

Đến nay, chưa công bố tiếp theo mô tả các kiểu hình đột biến xuất hiện.
656 J Mol Med (2010) 88: 653-664
Retinitis pigmentosa (RP) thường gây ra bệnh quáng gà sớm trong cuộc sống do mất tế bào cảm quang que. Các tế bào cảm quang hình nón còn lại từ từ thoái hóa hàng đầu cuối cùng đến mù lòa. Gen khác nhau và loci được gắn liền với
bệnh tật. Cả hai mô hình động vật gặm nhấm chuyển gen và loại trực tiếp của võng mạc loạn dưỡng góp phần vào sự phân tích của bệnh. So với con người, mô hình động vật gặm nhấm được giới hạn bởi hai nhược điểm, số lượng nhỏ và phân bố khác nhau của
neopromoter mã hóa chuỗi Bày tỏ lợn biến đổi gen
vector biểu hiện lựa chọn
thâm chuyển
chuyển phôi Selection
chuyển Hạt nhân tôi
chuyển hạt nhân II
Thành lập tế bào culturesEmbryo chuyển
Thai nhi hay con
Chiếu (hội nhập, expression)
Fig. 2 sản xuất hiệu quả của lợn biến đổi gen bằng cách sử dụng tế bào soma chuyển nhân. Một vector biểu hiện mang theo một lựa chọn băng di động được transfected vào các tế bào của nhà tài trợ hạt nhân. Sau khi lựa chọn, các tế bào chuyển gen kết quả được gộp lại và được sử dụng để chuyển nhân. Tổng hợp các thuộc địa của tế bào làm giảm thời gian trong văn hóa và cho phép các thế hệ độc lập bào thai người sáng lập / con trong một lứa đẻ. Phôi nhân bản được chuyển giao cho người nhận đồng bộ. Tùy thuộc
vào dự kiến khởi phát và mô đặc hiệu biểu hiện gen chuyển, mang thai có thể được chấm dứt vào hồi bào thai, hoặc sinh và phát triển của con cái được chờ đợi. Thai nhi hay mô từ con cái sinh ra sẽ được xử lý cho các nghiên cứu tích hợp gen chuyển và biểu hiện, trong khi nuôi cấy tế bào cá nhân được thành lập để tái nhân bản của các bào thai / con với phù hợp nhất tích hợp / biểu mẫu
Bảng 1 chuyển gen lợn như mô hình bệnh
bệnh nhân gen chuyển biểu hiện Tài liệu tham khảo
Biểu hiện của bệnh APPsw con người đột biến gien trong não Kragh PM et al Alzheimer. 2009 [32] bệnh Huntington chuyển gen động vật với lợn đột biến HTT Uchida M et al. 2001 [34] Retinitis pigmentosa biểu Retinal lợn đột biến RHOP347L hoặc RHOP347S Petters RM et al. 1997, Kraft TW et al. 2005 [36, 37] tim mạch bệnh nội mô qua biểu hiện của lợn Enos Hao YH et al. 2006 [40] Cystic fibrosis knockout CFTR hoặc lợn đột biến CFTRdeltaF508 Knockin Rogers CS et al. 2008 [28, 44] Đái tháo đường type 2 mellitus biểu Beta-cell của đột biến chi phối âm của con người GIPRdn Renner S et al. 2010 [56] Loại 3 của bệnh tiểu đường khởi phát sự trưởng thành của các biểu Beta-cell trẻ của đột biến của con người chi phối âm HNF1AP291fsinsC Umeyama K et al. 2009 [59]
J Mol Med (2010) 88: 653-664 657
tế bào cảm quang trong võng mạc và mắt nhỏ [35]. Vì vậy, con lợn biến đổi gen thể hiện một Rhodopsin lợn đột biến (RHO; P347L hay P347S) được sản xuất bởi phụ chuyển gen. Một gen DNA của heo 12,5 kb chứa 4-kb 5 'chuỗi chầu, các trình tự mã hóa cho các protein axit 348 amino và 2,9-kb 3' chầu trình tự của các lợn gen RHO đã được sử dụng cho các introductionofthemutationCCA (Pro) → CTA (Leu ) orTCA (Ser) trong codon 347. DNA vi tiêm của các vector biểu hiện cho Rhodopsin đột biến dẫn đến các thế hệ của dòng chuyển gen. Biểu hiện RNA võng mạc của gen chuyển đột biến vượt quá sự biểu hiện của sự hoang dại gen nội sinh. Giống như các bệnh nhân có đột biến tương tự, những con lợn biến đổi gen cho thấy mất sớm và nghiêm trọng của tế bào cảm quang thanh, và các tế bào cảm quang hình nón còn sống sót từ từ suy thoái. Các kiểu hình của đột biến RHO lợn biến đổi gen và các bệnh nhân RP có thể so sánh. Vì vậy, mô hình động vật tiểu thuyết này được mạnh mẽ được sử dụng để nghiên cứu bệnh học của viêm võng mạc sắc tố cũng như các thử nghiệm tiền lâm sàng điều trị [36, 37]. Hơn nữa, sản xuất của một mô hình chăn nuôi lợn biến đổi gen cho cột sống teo cơ, rối loạn lặn NST thường đặc trưng bởi sự thoái hóa của tế bào thần kinh vận động của tủy sống dẫn đến teo cơ, đã được công bố [38].
Các bệnh tim mạch
tế bào nội mô nitric oxide synthase (Enos) quy định chức năng mạch máu bằng cách giải phóng oxit nitric [39]. Lợn biến đổi gen đã được sản xuất để phân tích các quy định tim mạch bằng cách Enos. Các gen chuyển 7,3 kb gồm lợn 3,6 kb Yucatan Enos cDNA và một epitope V5 và tag polyhistidine (V5-ông tag) để phân biệt giữa Enos nội sinh và biến đổi gen đã được nhân bản giữa 2-kb TIE2 promoter và 1,7 kb TIE2 intron / yếu tố tăng cường khả năng cho các tế bào biểu hiện cụ thể nội mô. Các gen chuyển được dùng để hợp electroporation với neomycin gen kháng biểu hiện băng vào lợn Yucatan nguyên bào sợi bào thai cho phụ chuyển gen. Bốn con lợn biến đổi gen nhân bản xuất bởi các tế bào gen chuyển dương SCNTof bày tỏ phản ứng tổng hợp protein được bản địa hóa cho các tế bào nội mô mạch máu của nhau thai từ conceptuses như đã làm các Enos nội sinh. Kích thước dự đoán của Enos tái tổ hợp (1.242 axit amin) là 138 kDa, so với 133 kDa của nội sinh Enos (1.205 axit amin). Nội địa hóa của Enos nội sinh và chuyển gen tiết lộ những biểu hiện trong các tế bào nội mô. Những con lợn biến đổi gen được tiếp tục sử dụng để phân tích các chức năng của Enos trong việc điều chỉnh sự trao đổi chất cơ bắp và trong hệ thống tim mạch [40]. Ngoài ra, một mô hình loại trực tiếp bổ sung của Enos đã được công bố [41].
Cystic fibrosis
Sự thay đổi của các điều cystic fibrosis hành độ dẫn (1.480 axit amin) được xác định là gây ra các tính trạng lặn xơ nang mà vẫn không chữa được. Những con chuột với một gen CFTR bị gián đoạn không thành công để phát triển các bệnh về phổi và tuyến tụy gây ra hầu hết các bệnh tật và tử vong ở bệnh nhân [42]. Phổi lợn chia sẻ nhiều giải phẫu, mô học, sinh hóa, và đặc điểm sinh lý với phổi người [43]. Lợn đột biến đã được sản xuất bằng cách sử dụng SCNT và nguyên bào sợi của thai nhi với các gen CFTR hoặc bị gián đoạn hoặc có chứa xơ-nang liên quan đột biến thường gặp nhất (deltaF508). Vì vậy, tái tổ hợp vi rút adeno-associated (rAAV) vector đã được sử dụng để nhắm mục tiêu CFTR trong nguyên bào sợi của thai nhi nam ofoutbreddomesticpigs.The4.5-kbknockoutgeneconstruct gián đoạn exon 10 mã hóa một phần các nucleotide-binding domain1withastopcodonatposition508 (F508X) theo sau bởi một gen kháng neomycin floxed do các phosphoglycerate kinase (PGK) promoter, trong khi deltaF508 gen Knockin xây dựng bến cảng xóa ba nt trong exon 10 dẫn đến deltaF508 theo sau bởi một gen kháng neomycin floxed khiển bởi promoter PGK ở khu vực hạ lưu intronic. Sử dụng tế bào mục tiêu thành công mà không có trình tự vector virus cho SCNT, heo con đực mang đột biến dị hợp tử được tạo ra với mỗi đột biến [28, 44]. Lợn con sơ sinh với sự gián đoạn mục tiêu của cả hai alen CFTR trưng bày khuyết tật tương tự như đã thấy ở bệnh nhân sơ sinh, tức là phân su tắc ruột, phá hủy tuyến tụy ngoại tiết, và xơ gan mật đầu mối. Do đó, các mô hình căn bệnh mới có thể cải thiện việc phân tích cơ chế bệnh sinh cũng như sự phát triển của các chiến lược điều trị xơ nang [28, 44]. Ngoài ra, báo cáo hội nghị sơ kết công bố việc sản xuất của lợn biến đổi gen cho sự đàn áp biểu hiện CFTR do sự can thiệp RNA.
Đái tháo đường
Rodent mô hình cho bệnh đái tháo đường đã được phát triển bởi các biến đổi cấu trúc và / hoặc chức năng của gen ứng cử viên [45] hoặc bằng cách gây đột biến ngẫu nhiên chương trình [46]. Lợn biến đổi gen mới được thành lập như là mô hình động vật lớn. Trong bối cảnh các loại 2 bệnh tiểu đường, rối loạn chuyển hóa mạn tính của nhiều nguyên nhân gây bệnh đặc trưng bởi tăng đường huyết không kiểm soát được gây ra bởi cả hai kháng insulin và tiến bộ tụy beta-cell rối loạn chức năng [47], hai hormone incretin glucose insulinotropic polypeptide (GIP) và glucagon -like peptide-1 (GLP-1) thu hút sự chú ý đặc biệt. GIP và GLP-1 được tiết ra bởi các tế bào enteroendocrine để đáp ứng với các chất dinh dưỡng như chất béo và glucose và tăng cường bài tiết insulin glucose gây ra [48]. Trong loại 2 bệnh nhân tiểu đường, các hành động insulinotropic của GIP là
658 J Mol Med (2010) 88: 653-664
khiếm cao [49]. Gần duy trì insulinotropic hành động của GLP-1 loại 2 bệnh nhân tiểu đường cho thấy tiềm năng điều trị của mình để bù đắp cho sự mất mát của GIP chức năng và bắt đầu phát triển các phương pháp điều trị incretin dựa trên [50]. Những lý do để phản ứng giảm xuống GIP trong bệnh tiểu đường type 2 không rõ, nhưng có ý kiến cho rằng hành động khiếm GIP có thể được tham gia vào cơ chế bệnh sinh sớm của bệnh đái tháo đường type 2 [51]. Gần đây, một phân tích meta của chín nghiên cứu genome ở người cho thấy sự thay đổi trong GIP-receptor (GIPR) gen ảnh hưởng đến glucose và insulin phản ứng với một thách thức uống glucose [52]. Để làm rõ vai trò của các trục GIP / GIPR, một mô hình chuột thiếu biểu hiện của một GIPR chức năng được tạo ra bằng cách nhắm mục tiêu gen [53]. Gipr - / - chuột đang bày chỉ hơi khiếm dung nạp glucose và không phát triển bệnh tiểu đường. Quy định đền bù của hệ thống GLP-1 hoặc cơ chế đền bù khác đã được thảo luận như những giải thích có thể cho kiểu hình tương đối nhẹ này (xem xét trong [54]). Ngược lại, hai dòng độc lập của những con chuột biến đổi gen biểu hiện tốt GIPR chi phối âm (GIPRdn) dưới sự kiểm soát của promoter Ins2 chuột (RIP II) trong đảo tụy hiển thị khởi phát sớm bệnh đái tháo đường và mất mát của beta-tế bào kết hợp với mở rộng cấu trúc thay đổi của đảo tụy [55]. Tuy nhiên, nó không thể được loại trừ rằng kiểu hình nghiêm trọng quan sát thấy ở các đảo tụy của mô hình này là do hiệu ứng khác so với tín hiệu GIPR khiếm (ví dụ, squelching của G-protein, do đó suy / ức chế của con đường tín hiệu khác). Để giải quyết những vấn đề liệu hiệu GIPR đóng một vai trò trong việc duy trì chức năng đảo tụy và cơ cấu, mô hình động vật lớn đã được tạo ra [56]. Vector lentivirus hiệu quả được sử dụng để tạo lợn biến đổi gen thể hiện một GIPRdn dưới sự kiểm soát của chuột Ins2 promoter trong pancr