RESEARCH ARTICLETranscription Facto

RESEARCH ARTICLE
Transcription Factors and microRNA-Co-
Regulated Genes in Gastric Cancer Invasion
in Ex Vivo
Yue Shi1, Jihan Wang1, Zhuoyuan Xin1, Zipeng Duan1, Guoqing Wang1,2*, Fan Li1,2*
1 Department of Pathogenobiology, The Key Laboratory of Zoonosis, Chinese Ministry of Education, College
of Basic Medicine, Jilin University, Changchun, Jilin, China, 2 The Key Laboratory for Bionics Engineering,
Ministry of Education, China, Jilin University, Changchun, China
* [e-mail] (GQW); [e-mail] (FL)
Abstract
Aberrant miRNA expression abnormally modulates gene expression in cells and can contribute
to tumorigenesis in humans. This study identified functionally relevant differentially
expressed genes using the transcription factors and miRNA-co-regulated network analysis
for gastric cancer. The TF-miRNA co-regulatory network was constructed based on data obtained
from cDNA microarray and miRNA expression profiling of gastric cancer tissues. The
network along with their co-regulated genes was analyzed using Database for Annotation,
Visualization and Integrated Discovery (DAVID) and Transcriptional Regulatory Element
Database (TRED). We found eighteen (17 up-regulated and 1 down-regulated) differentially
expressed genes that were co-regulated by transcription factors and miRNAs. KEGG pathway
analysis revealed that these genes were part of the extracellular matrix-receptor interaction
and focal adhesion signaling pathways. In addition, qRT- PCR and Western blot data
showed an increase in COL1A1 and decrease in NCAM1 mRNA and protein levels in gastric
cancer tissues. Thus, these data provided the first evidence to illustrate that altered
gene network was associated with gastric cancer invasion. Further study with a large sample
size and more functional experiments is needed to confirm these data and contribute to
diagnostic and treatment strategies for gastric cancer.
Introduction
Gastric cancer is one of the most common form of malignancies in the world, contributing to a
third of cancer-related deaths in men and a fifth among women [1]. Approximately, two-thirds
of gastric cancer cases occur in the developing countries. In China, the incidence and mortality
related to gastric cancer ranks third among other forms of malignancies [2] and it was reported
that gastric cancer occurs more frequently in rural areas and with a trend of younger people
being affected by it in recent years [3]. Environmental (such as Helicobacter pylori infection or
consumption of smoked foods) and genetic factors (E-cadherin mutation) increases the susceptibility
to gastric cancer by inducing alterations in oncogenes/tumor suppressor genes and/or
PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0122882 April 10, 2015 1 / 13
OPEN ACCESS
Citation: Shi Y, Wang J, Xin Z, Duan Z, Wang G, Li F
(2015) Transcription Factors and microRNA-Co-
Regulated Genes in Gastric Cancer Invasion in Ex
Vivo. PLoS ONE 10(4): e0122882. doi:10.1371/
journal.pone.0122882
Academic Editor: Jian-Jun Zhao, Dana-Farber
Cancer Institute, UNITED STATES
Received: November 8, 2014
Accepted: February 24, 2015
Published: April 10, 2015
Copyright: © 2015 Shi et al. This is an open access
article distributed under the terms of the Creative
Commons Attribution License, which permits
unrestricted use, distribution, and reproduction in any
medium, provided the original author and source are
credited.
Data Availability Statement: All relevant data are
within the paper and its Supporting Information files.
Funding: This work was supported by grants from
National Natural Science Foundation of China
(#81320108025 and #81472662). It is also supported
in part by National Natural Science Foundation of
China (#81271897 and #81401712), Jilin Key
Laboratory of Biomedical Materials, Foundation of
Jilin Province Science and Technology Department
(#20130522013JH and #20140414048GH) and the
Norman Bethune Program of Jilin University
(#2012219).
epigenetic profile [4]. Alteration in these critical factors results in abnormal regulation of cell
growth, apoptosis, and differentiation thus promoting carcinogenesis. Multiple gene regulatory
networks co-ordinate the transformation of normal cell to a tumor cell and drive tumor progression.
However, to date, the detailed understanding of the underlying multiple gene regulatory
networks in pathogenesis of gastric cancer is yet to be defined. Determining the detailed
molecular mechanistic network associated with gastric cancer development and progression
could improve the understanding of carcinogenesis in gastric tissues, thus paving way for novel
and effective strategies in the prevention, diagnosis and treatment of gastric cancer.
Gene expression in cells is controlled both at transcription and post-transcriptional levels.
Transcription factors (TFs) coordinate gene transcription, while miRNAs regulates gene expression
by mediating post-transcriptional events, such as mRNA degradation and protein
translation [5]. Therefore, any alterations in miRNA function can result in the development of
cancer in humans [6,7]. Transcription factors are proteins that bind to specific DNA sequences
to control the rate of transcription of genetic information from DNA to mRNA [8,9], while
miRNAs are a group of a small non-coding RNA in cells and function in RNA silencing and
post-transcriptional regulation of gene expression [10,11]. The TF-miRNA gene regulatory
network determines the overall gene expression profile in cells to some extent. Therefore, analysis
of the TF-miRNA co-regulatory networks in gastric cancer tissues could help us to further
our understanding on how TFs and miRNAs coordinate the regulation of gene expression contributing
to gastric carcinogenesis [12]. In our previous study, we profiled differentially expressed
genes in eighty pairs of gastric carcinoma-adjacent normal tissues using cDNA
microarrays [13] and found a number of genes with altered expression, including TFs. Based
on the information from Transcriptional Regulatory Element Database (TRED) [14], we built
and consolidated a TF-gene regulatory network. In this study, we profiled differentially expressed
miRNAs in five pairs of gastric carcinoma-adjacent normal tissues and constructed a
miRNA-target regulatory network for gastric cancer by integrating the miRNA targeting gene
databases, including Targetscan, miRanda, miRDB, and miRWalk [15]. We then constructed
the TF-miRNA co-regulatory network using our previous data and then performed GO and
KEGG pathway analyses and performed real time PCR and western blot analysis to validate
these data. Thus, both of the methods and analyses could provide important clues for future
studies on miRNA and TFs functions in gastric cancer.
Materials and Methods
Tissue samples
A total of 25 gastric carcinoma patients were recruited for this study from The First Hospital of
Jilin University, Changchun, China. Gastric cancer tissues and the matching distant noncancerous
tissues were surgically resected and stored in liquid nitrogen within 10 min after the
resection. Written informed consents were obtained from all the subjects and the data were analyzed
anonymously. The TNM and histological classification were according to World Health
Organization (WHO) criteria. This study was approved by the Ethics Committee of College of
Basic Medical Sciences, Jilin University.
Profiling of differentially expressed mRNA and microRNA in gastric
cancer tissues
The differentially expressed mRNA data between gastric cancer and normal tissues was conducted
from 80 patients and reported previously [13]. We used
2-fold change to profile the
differentially expressed genes for this study.
TF/miRNA Co-Regulated Networks in Gastric Cancer
PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0122882 April 10, 2015 2 / 13
Competing Interests: The authors have declared
that no competing interests exist.
In this study, differentially expressed miRNAs in 5 pairs of gastric cancer–adjacent normal
tissues (see patients’ data in S2 Table) were profiled using Affymetrix miRNA microarray chips
according to the manufacturer’s protocols. Briefly, total RNA from tissue samples was isolated
using the Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and miRNA was isolated and purified using
the mirVana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX, USA) and then subjected to Gene
Chip microRNA array analysis. The data were scanned using GeneChip Scanner3000 with
GeneChip Operating Software (GCOS) and analyzed.
Construction of TF-gene, miRNA-targeting gene, and TF-miRNA coregulatory
networks
Based on the GeneChip Human Exon 1.0 ST microarray data (Affymetrix, CA, USA), we constructed
the TF-gene network by integrating gene expression profiles and transcriptional regulatory
element database (TRED). Regulatory interactions between microRNA and their target
genes were established based on information from Targetscan, miRanda, miRDB and miRWalk
database. The TF-miRNA co-regulatory networks were constructed by overlapping these two
sections. Hub-genes that co-regulated by TFs and miRNAs were also identified. The networks
were constructed using Cytoscape software (Institute of Systems Biology, USA, http://www.
cytoscape.org).
Functional annotations of selected genes
Online analytical tools such as Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery
(DAVID) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) were applied to explore
the functional pathway associated with differentially expressed genes. Significantly enriched
KEGG pathways with p < 0.01 were identified and analyzed further.
Quantitative RT-PCR (qRT-PCR)
For detect mRNA level, we utilized 5 μg total RNA samples of each sample to reversely transcribe
into cDNA with the first strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Dalian, China) and then
amplified using qPCR for expression of COL1A1, and NCAM1 mRNA with SYBR Premix Ex
Taq (Takara) in Applied Biosystems 7300 Fast Real-Time PCR System according to the manufacturers’
instructions. The relative expression of

Kết quả (Việt) 1:

NGHIÊN CỨU BÀI VIẾTYếu tố phiên mã và microRNA-Co -Quy định gien trong cuộc xâm lược của ung thư dạ dàyở Ex VivoYue Shi1, Jihan Wang1, Zhuoyuan Xin1, Zipeng Duan1, Guoqing Wang1, 2 *, fan hâm mộ Li1, 2 *1 các vùng Pathogenobiology, Phòng thí nghiệm chính của Zoonosis, Trung Quốc bộ giáo dục, trường đại họctrường đại học y học cơ bản, Cát Lâm, trường xuân, Cát Lâm, Trung Quốc, 2 phòng thí nghiệm chính Wireless kỹ thuật,Trung Quốc, bộ giáo dục đại học Jilin, Changchun, Trung Quốc* [e-mail] (GQW); [e-mail] (FL)Tóm tắtBiểu hiện bất thường Tam modulates biểu hiện gen trong các tế bào bất thường và có thể đóng gópđể tumorigenesis trong con người. Nghiên cứu này xác định chức năng có liên quan differentiallybày tỏ gen bằng cách sử dụng các yếu tố sao chép và phân tích Tam-co quy định mạngung thư dạ dày. Lực lượng đặc nhiệm-Tam co-regulatory mạng được xây dựng dựa trên dữ liệu thu đượctừ cDNA microarray và Tam biểu hiện profiling của các mô ung thư dạ dày. Cácmạng cùng với gen đồng quy định của họ được phân tích bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu cho chú thích,Kiểu trực quan và tích hợp phát hiện (DAVID) và Transcriptional yếu tố quy địnhCơ sở dữ liệu (TRED). Đã hiện lên mười tám (17 quy định mặc và 1 xuống quy định) differentiallybày tỏ gen đồng được quy định bởi các yếu tố phiên mã và miRNAs. KEGG đườngphân tích cho thấy rằng các gen là một phần của sự tương tác ngoại bào ma trận-thụ thểvà độ bám dính đầu mối báo hiệu con đường. Ngoài ra, Đảng Cộng sản Romania qRT và Western blot dữ liệushowed an increase in COL1A1 and decrease in NCAM1 mRNA and protein levels in gastriccancer tissues. Thus, these data provided the first evidence to illustrate that alteredgene network was associated with gastric cancer invasion. Further study with a large samplesize and more functional experiments is needed to confirm these data and contribute todiagnostic and treatment strategies for gastric cancer.IntroductionGastric cancer is one of the most common form of malignancies in the world, contributing to athird of cancer-related deaths in men and a fifth among women [1]. Approximately, two-thirdsof gastric cancer cases occur in the developing countries. In China, the incidence and mortalityrelated to gastric cancer ranks third among other forms of malignancies [2] and it was reportedthat gastric cancer occurs more frequently in rural areas and with a trend of younger peoplebeing affected by it in recent years [3]. Environmental (such as Helicobacter pylori infection orconsumption of smoked foods) and genetic factors (E-cadherin mutation) increases the susceptibilityto gastric cancer by inducing alterations in oncogenes/tumor suppressor genes and/orPLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0122882 April 10, 2015 1 / 13OPEN ACCESSCitation: Shi Y, Wang J, Xin Z, Duan Z, Wang G, Li F(2015) Transcription Factors and microRNA-Co-Regulated Genes in Gastric Cancer Invasion in ExVivo. PLoS ONE 10(4): e0122882. doi:10.1371/journal.pone.0122882Academic Editor: Jian-Jun Zhao, Dana-FarberCancer Institute, UNITED STATESReceived: November 8, 2014Accepted: February 24, 2015Published: April 10, 2015Copyright: © 2015 Shi et al. This is an open accessarticle distributed under the terms of the CreativeCommons Attribution License, which permitsunrestricted use, distribution, and reproduction in anymedium, provided the original author and source arecredited.Data Availability Statement: All relevant data arewithin the paper and its Supporting Information files.Funding: This work was supported by grants fromNational Natural Science Foundation of China(#81320108025 and #81472662). It is also supportedin part by National Natural Science Foundation ofChina (#81271897 and #81401712), Jilin KeyLaboratory of Biomedical Materials, Foundation ofJilin Province Science and Technology Department(#20130522013JH and #20140414048GH) and theNorman Bethune Program of Jilin University(#2012219).epigenetic profile [4]. Alteration in these critical factors results in abnormal regulation of cellgrowth, apoptosis, and differentiation thus promoting carcinogenesis. Multiple gene regulatorynetworks co-ordinate the transformation of normal cell to a tumor cell and drive tumor progression.However, to date, the detailed understanding of the underlying multiple gene regulatorynetworks in pathogenesis of gastric cancer is yet to be defined. Determining the detailedmolecular mechanistic network associated with gastric cancer development and progressioncould improve the understanding of carcinogenesis in gastric tissues, thus paving way for noveland effective strategies in the prevention, diagnosis and treatment of gastric cancer.Gene expression in cells is controlled both at transcription and post-transcriptional levels.Transcription factors (TFs) coordinate gene transcription, while miRNAs regulates gene expressionby mediating post-transcriptional events, such as mRNA degradation and proteintranslation [5]. Therefore, any alterations in miRNA function can result in the development ofcancer in humans [6,7]. Transcription factors are proteins that bind to specific DNA sequencesto control the rate of transcription of genetic information from DNA to mRNA [8,9], whilemiRNAs are a group of a small non-coding RNA in cells and function in RNA silencing andpost-transcriptional regulation of gene expression [10,11]. The TF-miRNA gene regulatorynetwork determines the overall gene expression profile in cells to some extent. Therefore, analysisof the TF-miRNA co-regulatory networks in gastric cancer tissues could help us to furtherour understanding on how TFs and miRNAs coordinate the regulation of gene expression contributingto gastric carcinogenesis [12]. In our previous study, we profiled differentially expressedgenes in eighty pairs of gastric carcinoma-adjacent normal tissues using cDNAMicroarrays [13] và tìm thấy một số gen với thay đổi biểu hiện, bao gồm cả TFs. dựatrên thông tin từ Transcriptional quy định nguyên tố cơ sở dữ liệu (TRED) [14], chúng tôi xây dựngvà củng cố lực lượng đặc nhiệm-gen quy định mạng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi profiled differentially bày tỏmiRNAs trong năm cặp của dạ dày mô lân cận ung thư biểu mô bình thường và xây dựng mộtTam-mục tiêu pháp lý mạng cho ung thư dạ dày bằng cách tích hợp Tam nhắm mục tiêu theo gencơ sở dữ liệu, bao gồm cả Targetscan, miRanda, miRDB, và miRWalk [15]. Chúng tôi sau đó xây dựnglực lượng đặc nhiệm-Tam co-regulatory mạng bằng cách sử dụng dữ liệu của chúng tôi trước và sau đó thực hiện đi vàKEGG con đường phân tích và thực hiện thời gian thực Đảng Cộng sản Romania và Tây blot phân tích để xác nhậnnhững dữ liệu này. Do đó, cả hai phương pháp và phân tích có thể cung cấp những manh mối quan trọng cho tương lainghiên cứu về Tam và TFs chức năng trong ung thư dạ dày.Vật liệu và phương phápMẫu môTổng cộng 25 Dạ dày ung thư bệnh nhân được tuyển dụng cho nghiên cứu này từ The bệnh viện đầu tiên củaĐại học Jilin, Changchun, Trung Quốc. Ung thư dạ dày mô và phù hợp với xa noncancerousmô đã được phẫu thuật resected và lưu trữ trong nitơ lỏng trong vòng 10 phút sau khi cácsự giải phẩu. Văn thông báo chấp thuận đã được thu được từ tất cả các đối tượng và các dữ liệu được phân tíchnặc danh. TNM và mô học phân loại đã theo y tế thế giớiTiêu chí tổ chức (WHO). Nghiên cứu này đã được phê duyệt bởi Ủy Ban Đại học đạo đức củaBasic Medical Sciences, Jilin University.
Profiling of differentially expressed mRNA and microRNA in gastric
cancer tissues
The differentially expressed mRNA data between gastric cancer and normal tissues was conducted
from 80 patients and reported previously [13]. We used
2-fold change to profile the
differentially expressed genes for this study.
TF/miRNA Co-Regulated Networks in Gastric Cancer
PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0122882 April 10, 2015 2 / 13
Competing Interests: The authors have declared
that no competing interests exist.
In this study, differentially expressed miRNAs in 5 pairs of gastric cancer–adjacent normal
tissues (see patients’ data in S2 Table) were profiled using Affymetrix miRNA microarray chips
according to the manufacturer’s protocols. Briefly, total RNA from tissue samples was isolated
using the Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and miRNA was isolated and purified using
the mirVana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX, USA) and then subjected to Gene
Chip microRNA array analysis. The data were scanned using GeneChip Scanner3000 with
GeneChip Operating Software (GCOS) and analyzed.
Construction of TF-gene, miRNA-targeting gene, and TF-miRNA coregulatory
networks
Based on the GeneChip Human Exon 1.0 ST microarray data (Affymetrix, CA, USA), we constructed
the TF-gene network by integrating gene expression profiles and transcriptional regulatory
element database (TRED). Regulatory interactions between microRNA and their target
genes were established based on information from Targetscan, miRanda, miRDB and miRWalk
database. The TF-miRNA co-regulatory networks were constructed by overlapping these two
sections. Hub-genes that co-regulated by TFs and miRNAs were also identified. The networks
were constructed using Cytoscape software (Institute of Systems Biology, USA, http://www.
cytoscape.org).
Functional annotations of selected genes
Online analytical tools such as Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery
(DAVID) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) were applied to explore
the functional pathway associated with differentially expressed genes. Significantly enriched
KEGG pathways with p < 0.01 were identified and analyzed further.
Quantitative RT-PCR (qRT-PCR)
For detect mRNA level, we utilized 5 μg total RNA samples of each sample to reversely transcribe
into cDNA with the first strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Dalian, China) and then
amplified using qPCR for expression of COL1A1, and NCAM1 mRNA with SYBR Premix Ex
Taq (Takara) in Applied Biosystems 7300 Fast Real-Time PCR System according to the manufacturers’
instructions. The relative expression of

Kết quả (Việt) 2:

NGHIÊN CỨU ĐIỀU
yếu tố phiên mã và microRNA-Co-
Genes Quy định trong dạ dày Ung thư xâm lược
trong Ex Vivo
Yue Shi1, Jihan Wang1, Zhuoyuan Xin1, Zipeng Duan1, Guoqing Wang1,2 *, Fan Li1,2 *
Vụ 1 của Pathogenobiology, Phòng thí nghiệm chính của zoonosis, Bộ Giáo dục Trung Quốc, Trường Đại học
Y khoa cơ bản, Đại học Cát Lâm, Trường Xuân, Cát Lâm, Trung Quốc, 2 Phòng thí nghiệm trọng cho The Bionics Kỹ thuật,
Bộ Giáo dục, Trung Quốc, Đại học Cát Lâm, Trường Xuân, Trung Quốc
* [e-mail] (GQW) ; [e-mail] (FL)
Tóm tắt
biểu hiện sai lệch miRNA bất thường điều biến biểu hiện gen trong tế bào và có thể đóng góp
vào khối u ở người. Nghiên cứu này xác định chức năng theo kiểu khác có liên quan
gen thể hiện bằng cách sử dụng các yếu tố phiên mã và phân tích mạng miRNA-co-quy
cho ung thư dạ dày. Các mạng lưới hợp lý TF-miRNA được xây dựng dựa trên các dữ liệu thu được
từ cDNA microarray và miRNA biểu profiling của các mô ung thư dạ dày. Các
mạng cùng với gen đồng quy định của họ đã được phân tích bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu cho chú thích,
Hình ảnh và tích hợp Discovery (DAVID) và phiên mã Điều tiết phần tử
cơ sở dữ liệu (TRED). Chúng tôi tìm thấy mười tám (17 up-regulated và 1 down-regulated) theo kiểu khác
gen biểu hiện đó là đồng quy định bởi các yếu tố phiên mã và miRNA. KEGG con đường
phân tích cho thấy những gen này là một phần của sự tương tác ma trận thụ ngoại bào
và đường dẫn tín hiệu bám dính tiêu cự. Ngoài ra, qRT- PCR và dữ liệu Western blot
cho thấy sự gia tăng trong COL1A1 và giảm NCAM1 mRNA và nồng độ protein trong dạ dày
các mô ung thư. Do đó, những dữ liệu này cung cấp bằng chứng đầu tiên cho thấy rằng thay đổi
mạng lưới gen liên quan với ung thư dạ dày xâm lược. Nghiên cứu tiếp theo với một mẫu lớn
kích thước và các thí nghiệm thêm chức năng là cần thiết để xác nhận các dữ liệu và đóng góp vào
chiến lược chẩn đoán và điều trị ung thư dạ dày.
Giới thiệu
bệnh ung thư dạ dày là một trong những hình thức phổ biến nhất của các khối u ác tính trên thế giới, góp phần vào một
phần ba số bệnh ung thư chết -related ở nam giới và một phần năm trong số các phụ nữ [1]. Khoảng hai phần ba
các trường hợp ung thư dạ dày xảy ra ở các nước đang phát triển. Ở Trung Quốc, tỷ lệ mắc và tử vong
liên quan đến ung thư dạ dày đứng hàng thứ ba trong số các hình thức khác của bệnh lý ác tính [2] và nó đã được báo cáo
rằng bệnh ung thư dạ dày xảy ra thường xuyên hơn ở khu vực nông thôn và với xu hướng của những người trẻ
bị ảnh hưởng bởi nó trong những năm gần đây [3 ]. Môi trường (chẳng hạn như nhiễm trùng Helicobacter pylori hoặc
tiêu thụ các loại thực phẩm hun khói) và các yếu tố di truyền (E-cadherin đột biến) làm tăng tính nhạy cảm
với ung thư dạ dày bằng cách gây biến đổi trong gen gây ung thư / gen ức chế khối u và / hoặc
trên tạp chí PLoS ONE | DOI: 10,1371 / journal.pone .0122882 10 tháng tư năm 2015 1/13
MỞ ACCESS
Citation: Shi Y, Wang J, Xin Z, Z Duẩn, Wang G, Li F
(2015) Các yếu tố phiên mã và microRNA-Co-
Genes Quy định trong dạ dày Ung thư xâm lược trong Ex
Vivo. PLoS ONE 10 (4): e0122882. doi: 10,1371 /
journal.pone.0122882
Academic Editor: Jian-Jun Zhao, Dana-Farber
Cancer Institute, UNITED STATES
nhận: 08 tháng 11 năm 2014
chấp nhận: ngày 24 tháng 2 năm 2015
Được đăng: 10 Tháng Tư năm 2015
Copyright: © 2015 Shi et al . Đây là một lối vào mở
bài viết phân phối theo các điều khoản của Creative
Commons License Attribution, cho phép
sử dụng không hạn chế, phân phối và sinh sản trong bất kỳ
môi trường, cung cấp các tác giả gốc và nguồn được
ghi.
Dữ liệu Phát Biểu Tình trạng: Tất cả dữ liệu có liên quan
trong phạm vi giấy . Hỗ trợ các tập tin và thông tin của nó
tài trợ: Công trình này được tài trợ bởi
Quỹ khoa học tự nhiên quốc gia Trung Quốc
(# 81320108025 và # 81.472.662). Nó cũng được hỗ trợ
một phần bởi Quỹ Khoa học Quốc gia tự nhiên của
Trung Quốc (# 81.271.897 và 81.401.712 #), Key Jilin
Phòng thí nghiệm Vật liệu y sinh, Foundation của
tỉnh Sở Khoa học và Công nghệ Jilin
(# 20130522013JH và # 20140414048GH) và
Chương trình Norman Bethune Cát Lâm Đại học
(# 2.012.219).
hồ sơ biểu sinh [4]. Thay đổi trong những yếu tố quan trọng dẫn đến quy định bất thường của các tế bào
tăng trưởng, apoptosis, và sự khác biệt đó thúc đẩy ung thư. Nhiều quy định gen
mạng Phối hợp việc chuyển đổi của các tế bào bình thường để một tế bào khối u và sự tiến triển của khối u ổ đĩa.
Tuy nhiên, cho đến nay, sự hiểu biết chi tiết về các quy định nhiều gen cơ bản
mạng trong sinh bệnh học của bệnh ung thư dạ dày vẫn chưa được xác định. Xác định các chi tiết
mạng lưới cơ học phân tử liên quan với sự phát triển ung thư dạ dày và sự tiến triển
có thể cải thiện sự hiểu biết về ung thư ở các mô dạ dày, do đó mở đường cho tiểu thuyết
chiến lược và hiệu quả trong việc phòng ngừa, chẩn đoán và điều trị ung thư dạ dày.
biểu hiện gen trong tế bào được điều khiển cả phiên mã và mức sau phiên mã.
yếu tố phiên mã (TF) phối hợp phiên mã gen, trong khi miRNA chỉnh biểu hiện gen
bởi trung gian các sự kiện sau phiên mã, chẳng hạn như suy thoái mRNA và protein
dịch [5]. Vì vậy, bất kỳ thay đổi trong chức năng miRNA có thể dẫn đến sự phát triển của
bệnh ung thư ở người [6,7]. Các yếu tố phiên mã là các protein với các chuỗi DNA cụ thể
để kiểm soát tốc độ của phiên mã thông tin di truyền từ DNA sang RNA [8,9], trong khi
miRNA là một nhóm của một RNA không mã hóa nhỏ trong các tế bào và chức năng trong RNA im lặng và
bài quy định -transcriptional biểu hiện gen [10,11]. TF-miRNA gen quy định
mạng xác định hồ sơ cá nhân biểu hiện gen tổng thể trong các tế bào ở một mức độ. Vì vậy, phân tích
của các mạng TF-miRNA hợp lý trong các mô ung thư dạ dày có thể giúp chúng tôi để tiếp tục
sự hiểu biết của chúng tôi về cách TF và miRNA phối hợp điều hòa biểu hiện gen góp phần
gây ung thư dạ dày để [12]. Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi, chúng tôi cấu hình theo kiểu khác thể hiện
gen trong tám mươi cặp của các mô bình thường ung thư biểu mô dạ dày tiếp giáp sử dụng cDNA
microarray [13] và tìm thấy một số gen có biểu hiện thay đổi, bao gồm TF. Dựa
trên những thông tin từ cơ sở dữ liệu phiên mã Điều tiết Element (TRED) [14], chúng tôi xây dựng
và củng cố mạng lưới quy TF-gen. Trong nghiên cứu này, chúng ta cấu hình theo kiểu khác thể hiện
miRNA trong năm cặp dạ dày các mô bình thường ung thư biểu mô lân cận và xây dựng một
mạng lưới quy miRNA mục tiêu đối với ung thư dạ dày bằng cách tích hợp các gen mục tiêu miRNA
cơ sở dữ liệu, bao gồm cả Targetscan, Miranda, miRDB, và miRWalk [15] . Sau đó chúng tôi xây dựng
các mạng lưới TF-miRNA hợp pháp bằng cách sử dụng dữ liệu trước đó của chúng tôi và sau đó thực hiện GO và
KEGG phân tích theo đường và thực hiện thời gian thực PCR và phân tích western blot để xác nhận
các dữ liệu này. Như vậy, cả hai phương pháp phân tích và có thể cung cấp manh mối quan trọng cho tương lai
nghiên cứu về miRNA và TF chức năng trong ung thư dạ dày.
Vật liệu và phương pháp
lấy mẫu mô
Tổng cộng có 25 bệnh nhân ung thư dạ dày đã được tuyển dụng cho nghiên cứu này từ Bệnh viện đầu tiên của
Đại học Cát Lâm, Trường Xuân , Trung Quốc. Các mô ung thư dạ dày và phù hợp với không ung thư xa
mô đã được phẫu thuật cắt bỏ và được lưu trữ trong nitơ lỏng trong vòng 10 phút sau khi
cắt bỏ. Bản chấp thuận bằng văn bản được lấy từ tất cả các đối tượng và các dữ liệu được phân tích
nặc danh. Các TNM và phân loại mô học đã theo Y tế Thế giới
tổ chức (WHO) tiêu chuẩn. Nghiên cứu này đã được sự chấp thuận của Ủy ban Đạo đức của trường Cao đẳng
cơ bản khoa học y học, Đại học Cát Lâm.
Profiling các kiểu khác bày tỏ mRNA và microRNA trong dạ dày
ung thư mô
Các dữ liệu mRNA theo kiểu khác bày tỏ giữa các mô ung thư dạ dày bình thường và đã được tiến hành
từ 80 bệnh nhân và báo cáo trước đây [13 ]. Chúng tôi đã sử dụng? Thay đổi 2 lần vào hồ sơ các
gen theo kiểu khác bày tỏ cho nghiên cứu này.
TF / Networks miRNA Co-RegulaTed trong dạ dày Ung thư
PLoS ONE | DOI: 10,1371 / journal.pone.0122882 10 Tháng Tư 2015 2/13
Cạnh tranh Sở thích: Các tác giả đã tuyên bố
mà không có lợi ích cạnh tranh tồn tại.
Trong nghiên cứu này, các kiểu khác thể hiện miRNA trong 5 cặp dạ dày bình thường ung thư giáp
mô (xem dữ liệu của bệnh nhân trong S2 Table) được cấu hình sử dụng Affymetrix miRNA chip microarray
theo giao thức của nhà sản xuất. Tóm lại, tổng số RNA từ các mẫu mô được phân lập
bằng cách sử dụng Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) và miRNA được phân lập và tinh chế bằng cách sử dụng
các mirVana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX, USA) và sau đó được Gene
mảng Chip microRNA phân tích. Các số liệu được quét bằng GeneChip Scanner3000 với
GeneChip Phần mềm điều hành (GCOS) và phân tích.
Xây dựng TF-gen, miRNA-gen targeting, và TF-miRNA coregulatory
mạng
Dựa trên GeneChip Nhân Exon 1.0 ST dữ liệu microarray (Affymetrix, CA, USA ), chúng tôi xây dựng
các mạng lưới TF-gen bằng cách tích hợp biểu hiện gen phiên mã và quy định
cơ sở dữ liệu phần tử (TRED). Tương tác giữa các microRNA điều tiết và mục tiêu của họ
gen đã được thành lập dựa trên thông tin từ Targetscan, Miranda, miRDB và miRWalk
cơ sở dữ liệu. Các mạng lưới hợp lý TF-miRNA được xây dựng bằng cách lồng ghép những hai
phần. Hub-gen đồng theo quy định của TF và miRNA cũng đã được xác định. Các mạng
đã được xây dựng bằng cách sử dụng phần mềm Cytoscape (Institute of Systems Biology, USA, http:. // www
cytoscape.org).
chú thích chức năng của các gen chọn lọc
các công cụ trực tuyến phân tích như: Cơ sở dữ liệu cho chú thích, Hình ảnh và tích hợp Discovery
(DAVID) và Kyoto Bách khoa toàn thư gen và Genome (KEGG) đã được áp dụng để khám phá
những con đường chức năng liên quan đến gen kiểu khác bày tỏ. Đáng kể làm giàu
KEGG đường xu với p <0,01 được xác định và phân tích thêm.
định lượng RT-PCR (QRT-PCR)
Đối với phát hiện mức độ mRNA, chúng ta sử dụng 5 mg tổng số mẫu RNA của mỗi mẫu để đổi lại phiên âm
thành cDNA với các sợi đầu tiên Tổng hợp cDNA Kit (Takara, Đại Liên, Trung Quốc) và sau đó
khuếch đại sử dụng qPCR cho biểu hiện của COL1A1, và NCAM1 mRNA với SYBR Premix Ex
Taq (Takara) trong Applied Biosystems 7300 Hệ thống PCR nhanh Real-Time theo của nhà sản xuất
hướng dẫn. Các biểu hiện tương đối của