6. Trypsinize human keratinocytes f

6. Trypsinize human keratinocytes from culture flasks with 0.05% trypsin/EDTA, neutralize trypsin with soy bean trypsin inhibitor (250 mg/L in 1x phosphate buffered saline), spin down, resuspend a cell pellet at 4.17 x106 cells/mL in skin reconstruct medium I.
7. Trypsinize human melanocytes or melanoma cells from culture flasks with 0.05% trypsin/EDTA, neutralize trypsin with soy bean trypsin inhibitor, spin down, resuspend a cell pellet at 0.83 x106 cells/mL in skin reconstruct medium I.
8. Remove washing medium from both inside and outside of each insert.
9. Add skin reconstruct medium I (1.5 mL to the inside and 10 mL to the outside of each insert).
10. Take 600 μl cell suspension of keratinocytes and 600 μl cell suspension of melanocytes or melanoma cells, mix well. Dispense 200 μl mixed cell suspension drop by drop to the inside of each insert. For dermal stem cell reconstruct, use 100 μl of keratinocyte suspension only. Incubate for 2 days at 37 °C.
11. Aspirate skin reconstruct medium I from both the inside and the outside of each insert. Add skin reconstruct medium II (2 mL to the inside and 10 mL to the outside). Incubate for another 2 days at 37 °C.
12. Aspirate skin reconstruct medium II from the inside and the outside of each insert, add 7.5 mL skin reconstruct medium III to only the outside. From this point, the surface of reconstructs starts being exposed to the air. Change medium III every other day until day 18.
13. Harvest skin reconstruct at day 18:
1. Aspirate media from the inside and the outside of inserts.
2. Remove inserts from tray with forceps.
3. Cut out the reconstruct (including the polycarbonate filter) by tracing a circle close to the edge with a scalpel blade.
4. Cut the reconstruct and the filter in half on a hard surface.

14. For paraffin sections: place a half of the reconstruct in a histology cassette between 2 black TBS biopsy papers and soak the whole cassette in 10% formalin for more than 4 hours. Then place the cassette in 70% ethanol and store it at 4 °C until you are ready to process the reconstruct for paraffin embedding.
15. For frozen sections:
1. Place the other half of reconstruct in 50% sucrose at 4 °C for 1-2 hours, then change the sucrose to 2M and store it at 4 °C for another 1-2 hours.
2. Dispense optimal cutting temperature freezing media (OCT) into a disposable base mold so that it fills about 50% of the boat. Avoid any bubbles in the OCT.
3. Grab the edge of the reconstruct with forceps and remove the reconstruct from the sucrose. Place it on Kimwipes until the Kimwipes absorb the sucrose.
4. Transfer the reconstruct into the base mold on top of the OCT, using forceps and a spatula. Cover the top of the reconstruct with more OCT until the base mold is completely full. Make sure you do not have any bubbles in the OCT which will make cutting difficult.
5. Place the base mold evenly on crushed dry ice, and allow the OCT to freeze completely.
6. Wrap the base mold in tin foil and store it at -70 °C until you are ready to cut it with a cryostat.

16. Graft a skin reconstruct on a mouse:
1. Prepare a 50 mL falcon tube with 5 mL of DMEM (for freezing and defrosting mouse skin).
2. Use a female SCID hairless outbred mouse around 6 weeks.
3. The mouse is anesthetized with isoflurane (EZ anesthesia system): initial anesthesia is performed in the induction chamber with 4% isoflurane (before mouse is moved to the surgical bed) and maintain anesthesia through a nosecone breather during procedure
(isoflurane: 1.5-2%). Heat support by a heated pad to prevent hypothermia and sterile ophthalmic lubricant applied to prevent ocular injury during anesthesia.
4. Put 600 mL water in a beaker and leave on top of a hot plate to keep water temperature between 40 - 60 °C.
5. Clean the mouse skin with compound benzoin tincture and alcohol prep swabs.
6. Mark a line on top of the mouse back to keep the same position for suturing later.
7. Cut a round wound bed about 1.2 cm in diameter on the mouse upper back using Iris scissors and forceps. Cover the wound bed with sterile gauze sponges. Put the round mouse skin in 5 mL of DMEM, then leave in liquid nitrogen container until it totally frozen. Defrost the tube in hot water on top of a hot plate until totally thawed. Repeat 3 times.
8. Detach the skin reconstruct from the transwell using surgical blade and remove the membrane very carefully, transfer the skin reconstruct (epidermis side up) on top of the wound bed.
9. Place the mouse skin (epidermis side up) on top of the skin reconstruct.
10. Make the first suture on the marker previously labeled, the second on the bottom, then two more sutures on sides to fix the mouse skin.
11. Clean mouse skin after grafting. Remove nosecone and keep mouse on the heated pad until awake and ambulatory.
12. Put the mouse into a new cage.
13. Post operative analgesia: Meloxicam (1 mg/kg) by subcutaneous injection immediately after surgery, 24 hours and 48 hours

Kết quả (Việt) 1:

6. trypsinize keratinocytes của con người từ văn hóa bình với 0,05% trypsin/EDTA, vô hiệu hóa trypsin với chất ức chế trypsin đậu tương (250 mg/L 1 x dung dịch muối đệm phosphat), quay xuống, resuspend viên di động tại 4.17 x106 tế bào/mL ở da tái tạo lại vừa tôi.7. trypsinize melanocytes của con người hoặc các tế bào khối u ác tính từ nền văn hóa bình với 0,05% trypsin/EDTA, vô hiệu hóa trypsin với chất ức chế trypsin đậu tương, quay xuống, resuspend viên di động tại 0,83 x106 tế bào/mL ở da tái tạo lại vừa tôi.8. loại bỏ phương tiện rửa từ cả hai bên trong và bên ngoài của mỗi chèn.9. thêm làn da tái tạo lại vừa tôi (1.5 mL vào bên trong và ngoài chèn mỗi 10 mL).10. mất 600 μl di động đình chỉ keratinocytes và 600 μl di động đình chỉ melanocytes hoặc các tế bào khối u ác tính, trộn đều. Tha cho 200 μl hỗn hợp tế bào treo thả bằng cách thả vào bên trong của mỗi chèn. Để tái tạo lại các tế bào gốc, sử dụng 100 μl keratinocyte treo chỉ. Ấp cho nở trong 2 ngày ở 37 ° C.11. aspirate da tái tạo lại vừa tôi từ cả bên trong và bên ngoài của mỗi chèn. Thêm phương tiện tái tạo lại làn da II (2 mL vào bên trong và 10 mL để bên ngoài). Ấp cho nở thêm 2 ngày ở 37 ° C.12. aspirate da tái tạo lại vừa II từ bên trong và bên ngoài của mỗi insert, thêm 7,5 mL da tái tạo lại vừa III chỉ bên ngoài. Từ thời điểm này, bề mặt của reconstructs bắt đầu được tiếp xúc với không khí. Thay đổi III trung bình mỗi ngày cho đến ngày 18.13. thu hoạch da tái tạo lại ngày 18:1. aspirate phương tiện truyền thông từ bên trong và bên ngoài của chèn.2. loại bỏ chèn từ khay với kẹp.3. cắt ra tái tạo lại (bao gồm các bộ lọc polycarbonate) bởi tracing một vòng tròn gần với các cạnh với một lưỡi dao.4. giảm sự tái tạo lại và các bộ lọc một nửa trên một bề mặt cứng.14. cho dầu thô paraffin phần: đặt một nửa của sự tái tạo lại trong một tổ chức học cassette giữa 2 TBS black sinh thiết giấy tờ và hấp thụ toàn bộ cassette trong 10% formalin cho hơn 4 giờ. Sau đó đặt cassette trong 70% ethanol và lưu trữ nó ở 4 ° C cho đến khi bạn đã sẵn sàng cho quá trình tái tạo lại cho dầu thô paraffin nhúng.15. đối với phần đông lạnh:1. nơi nửa kia của tái tạo lại ở 50% sucrose ở 4 ° C cho 1-2 giờ, sau đó thay đổi Sucroza 2M và lưu trữ nó ở 4 ° C cho một 1-2 giờ.2. phân chia các nhiệt độ tối ưu cắt đóng băng phương tiện truyền thông (OCT) vào một cơ sở khuôn dùng một lần để cho nó lấp đầy khoảng 50% của tàu. Tránh bong bóng bất kỳ trong OCT.3. lấy các cạnh của việc tái tạo lại bằng cách kẹp và loại bỏ sự tái tạo lại từ sucrose. Đặt nó trên Kimwipes cho đến khi Kimwipes sự hấp thụ sucrose.4. chuyển tái tạo lại vào khuôn căn cứ trên đầu trang của OCT, bằng cách sử dụng kẹp và một thìa. Bao gồm đầu tái tạo lại với OCT thêm cho đến khi các mốc cơ sở là hoàn toàn đầy đủ. Đảm bảo rằng bạn không có bất kỳ bong bóng trong OCT mà sẽ làm cho cắt khó khăn.5. đặt cơ sở khuôn đồng đều trên đá khô nghiền nát, và cho phép OCT đóng băng hoàn toàn.6. bọc khuôn cơ sở tại foil thiếc và lưu trữ nó ở-70 ° C cho đến khi bạn đã sẵn sàng để cắt nó với một cryostat.16. ghép tái tạo lại làn da trên một con chuột:1. chuẩn bị một ống falcon 50 mL với 5 mL DMEM (đóng băng và nặn chuột da).2. sử dụng một nữ SCID lông outbred chuột khoảng 6 tuần.3. chuột anesthetized với isoflurane (hệ thống gây mê EZ): ban đầu gây tê được thực hiện trong buồng cảm ứng với 4% isoflurane (trước khi con chuột được di chuyển đến phẫu thuật giường) và duy trì gây tê thông qua tạm nghỉ nosecone trong khi phẫu thuật(isoflurane: 1,5-2%). Nhiệt độ các hỗ trợ của một pad sưởi ấm để ngăn ngừa hạ thân nhiệt và chất bôi trơn mắt vô trùng được áp dụng để ngăn ngừa chấn thương mắt trong quá trình gây mê.4. cho 600 mL nước trong cốc một và để lại trên đầu trang của một tấm nóng để giữ nhiệt độ nước giữa 40-60 ° C.5. làm sạch da chuột với hợp chất benzoin swabs chuẩn bị cồn và rượu.6. đánh dấu dòng trên đầu trang của chuột quay lại giữ vị trí tương tự cho suturing sau này.7. cắt một giường tròn vết thương khoảng 1.2 cm đường kính trên chuột trên trở lại bằng cách sử dụng Iris kéo và kẹp. Bao gồm giường vết thương với miếng gạc vô trùng bọt biển. Đưa chuột vòng da trong 5 mL DMEM, sau đó để lại trong thùng chứa nitơ lỏng cho đến khi nó hoàn toàn đông lạnh. Defrost ống trong nước nóng trên đầu trang của một tấm nóng cho đến khi hoàn toàn xả đá. Lặp lại 3 lần.8. tách tái tạo lại làn da từ transwell bằng cách sử dụng lưỡi dao phẫu thuật và loại bỏ các màng tế bào rất cẩn thận, chuyển tái tạo lại làn da (lớp biểu bì phía lên) trên giường vết thương.9. đặt chuột da (lớp biểu bì phía lên) trên đầu trang của tái tạo lại làn da.10. thực hiện khâu đầu tiên vào các điểm đánh dấu có nhãn trước đó, lần thứ hai về phía dưới, sutures thêm sau đó hai bên để sửa chữa làn da con chuột.11. làm sạch da chuột sau khi ghép. Loại bỏ nosecone và giữ chuột trên các phím nóng cho đến khi tỉnh táo và di động.12. đưa chuột vào một lồng mới.13. bài tác đều: Meloxicam (1 mg/kg) bằng cách tiêm dưới da ngay sau khi phẫu thuật, 24 giờ và 48 giờ

Kết quả (Việt) 2:

6. Trypsinize tế bào sừng của con người từ bình nuôi cấy với 0,05% trypsin / EDTA, trung hòa trypsin với đậu nành đậu trypsin inhibitor (250 mg / L trong 1x phosphate mặn đệm), quay xuống, resuspend một viên di động tại 4,17 tế bào x106 / mL trong tái tạo lại làn da I. trung bình
7. Trypsinize melanocytes con người hoặc các tế bào khối u ác tính từ bình nuôi cấy với 0,05% trypsin / EDTA, hóa giải trypsin với đậu nành chất ức chế trypsin, quay xuống, resuspend một viên di động tại 0,83 tế bào x106 / mL trong da tái tạo I. trung bình
8. Di vừa rửa từ cả bên trong và bên ngoài của mỗi chèn.
9. Thêm tái tạo lại da trung bình I (1,5 ml vào bên trong và 10 mL ra bên ngoài của mỗi chèn).
10. Lấy 600 ml dịch treo tế bào của tế bào sừng và 600 treo tế bào melanocytes ml hoặc các tế bào hắc tố, trộn đều. Bôi 200 ml hỗn hợp thả treo tế bào bằng cách thả vào bên trong của mỗi chèn. Đối với da tái tạo lại tế bào gốc, sử dụng 100 ml chỉ treo keratinocyte. Ủ trong 2 ngày 37 ° C.
11. Hút da tái tạo lại môi tôi từ cả bên trong và bên ngoài của mỗi chèn. Thêm da tái tạo lại môi trường II (2 mL vào bên trong và 10 ml với bên ngoài). Ủ thêm 2 ngày ở 37 ° C.
12. Da Hút tái tạo lại môi trường II từ bên trong và bên ngoài của mỗi chèn, thêm 7,5 ml da tái tạo lại vừa III chỉ bên ngoài. Từ thời điểm này, bề mặt của tái cấu trúc bắt đầu được tiếp xúc với không khí. Thay đổi môi trường III mỗi ngày khác cho đến ngày 18.
13. Harvest da tái tạo lại tại ngày 18:
1. Hút phương tiện truyền thông từ bên trong và bên ngoài chèn.
2. Di chèn từ khay với kẹp.
3. Cắt ra tái tạo lại (bao gồm cả bộ lọc polycarbonate) bởi truy tìm một vòng tròn gần mép với một lưỡi dao.
4. Cắt xây dựng lại và các bộ lọc trong nửa trên một bề mặt cứng.

14. Đối với phần parafin: đặt một nửa của tái tạo lại trong một băng mô học giữa 2 giấy tờ sinh thiết TBS đen và ngâm toàn bộ băng trong formalin 10% trong hơn 4 giờ. Sau đó, đặt băng ở 70% ethanol và lưu trữ nó ở 4 ° C cho đến khi bạn có sẵn sàng để xử lý tái tạo lại cho paraffin nhúng.
15. Đối với phần đông lạnh:
1. Đặt nửa kia của tái tạo lại 50% sucrose tại 4 ° C trong 1-2 giờ, sau đó thay đổi sucrose đến 2M và lưu trữ nó ở 4 ° C thêm 1-2 giờ.
2. Chia cắt tối ưu đóng băng nhiệt độ phương tiện truyền thông (OCT) vào một khuôn cơ sở dùng một lần để nó lấp đầy khoảng 50% của các thuyền. Tránh bất kỳ bong bóng trong OCT.
3. Grab các cạnh của tái tạo lại với kẹp và loại bỏ các tái tạo lại từ sucrose. Đặt nó trên Kimwipes cho đến khi Kimwipes hấp thụ sucrose.
4. Chuyển tái tạo lại khuôn cơ sở trên OCT, sử dụng kẹp và một thìa. Che đầu tái tạo lại với nhiều tháng mười cho đến khi khuôn cơ bản là hoàn toàn đầy đủ. Hãy chắc chắn rằng bạn không có bất kỳ bong bóng trong tháng mười mà sẽ làm giảm khó khăn.
5. Đặt khuôn cơ sở đều trên băng khô nghiền nát, và cho phép OCT đóng băng hoàn toàn.
6. Quấn khuôn cơ sở trong lá thiếc và lưu trữ nó ở -70 ° C cho đến khi bạn đã sẵn sàng để cắt nó với một -cryostat.

16. Ghép một tái tạo lại làn da trên một con chuột:
1. Chuẩn bị một mL ống 50 ưng với 5 ml DMEM (để đông lạnh và rã đông da chuột).
2. Sử dụng một nữ SCID chuột outbred không lông trong khoảng 6 tuần.
3. Những con chuột được gây mê với isoflurane (hệ thống gây mê KKT): gây mê ban đầu được thực hiện trong buồng cảm ứng với 4% isoflurane (trước khi chuột di chuyển đến giường phẫu thuật) và duy trì gây mê thông qua tạm nghỉ nosecone trong thủ tục
(isoflurane: 1,5-2% ). Hỗ trợ nhiệt bằng một miếng đệm nóng để ngăn ngừa hạ thân nhiệt và chất bôi trơn mắt vô trùng áp dụng để ngăn ngừa chấn thương mắt trong khi gây mê.
4. Đặt 600 ml nước trong một cốc thủy tinh và để lại trên một tấm nóng để giữ nhiệt độ nước từ 40 -. 60 ° C
5. Làm sạch da chuột có cồn hợp chất benzoin và gạc chuẩn bị rượu.
6. Đánh dấu một dòng trên cùng của chuột trở lại để giữ vị trí tương tự cho khâu sau.
7. Cắt một vết thương tròn giường khoảng 1,2 cm, đường kính trên chuột lưng sử dụng kéo Iris và kẹp. Che giường vết thương với bọt biển gạc vô trùng. Đặt da chuột vòng trong 5 ml DMEM, sau đó để lại trong thùng chứa nitơ lỏng cho đến khi nó hoàn toàn đông lạnh. Xả đá ống nước nóng trên một tấm nóng cho đến khi hoàn toàn tan đá. Lặp lại 3 lần.
8. Tháo tái tạo da từ transwell sử dụng lưỡi dao phẫu thuật và gỡ bỏ các màng rất cẩn thận, tái tạo lại chuyển da (biểu bì bên up) trên đầu giường vết thương.
9. Đặt da chuột (biểu bì bên lên) trên đầu của tái tạo lại da.
10. Hãy khâu đầu tiên vào điểm đánh dấu nhãn trước đây, lần thứ hai vào phía dưới, sau đó thêm hai khâu trên mặt để sửa chữa da chuột.
11. Da chuột sạch sẽ sau khi ghép. Di nosecone và giữ chuột trên bệ nước nóng cho đến khi tỉnh táo và cấp cứu.
12. Đưa chuột vào một cái lồng. Mới
13. Bài thuốc giảm đau tác: Meloxicam (1 mg / kg) bằng cách tiêm dưới da ngay sau khi phẫu thuật, 24 giờ và 48 giờ