MATERIALS AND METHODS Plantmaterial

MATERIALS AND METHODS Plantmaterial
High productive doubled haploid (DH) lines of winter oilseed rape (Brassica napus L.) as a source of mesophyll protoplasts BN-OP-01 and BN-SL-03/04 and genotypes of Ethiopian mustard (Brassica carinata A. Braun) – DH line BC Dodolla and breeding materials BC-1 and BC-6 – as a source of hypocotyl protoplasts were used for experiments. To obtain sterile plant material for establishing protoplast cultures, seeds of above mentioned genotypes were surface sterilized in 70% ethanol for one minute, followed by immersion in 30% commercial bleach Savo (on the basis of NaClO) for twenty minutes and finally by washing procedure with sterile distilled water three times. MS medium without growth regulators was used for germination of seedlings. Seeds of genotypes intended for hypocotyl protoplasts were incubated in a thermostat at 25°C in the dark; those for mesophyll protoplasts were kept in a cultivation room and cultivated under controlled environmental conditions (25°C and 16/8h day/night photoperiod and light intensity 260 μmol/m2/s).
Protoplast isolation and fusion
Seven-day old hypocotyls and leaves from one-month- old in vitro plants were cut into 1mm segments and treated separately in different Petri dishes with the enzyme solution, containing 0.25% macerozyme R10 (Serva) and 1% cellulase Onozuka R 10 (Serva) in W5 salt solution (Potrykus and Shillito, 1986, Mukhopadhyay et al., 1994). Cut tissue was incubated for 18 hours in a thermostat at 25°C without shaking. Incubated mixtures were filtered separately through a 50 μm nylon mesh and transferred to 10 ml centrifuge tubes. Suspensions were centrifuged at 100g for 5 minutes. After careful supernatant removal, 4 ml of 20% sucrose solution was mixed with the protoplast suspension and then gently covered with 2 ml W5 salt solution without disturbing the protoplast suspension. Suspensions were again centrifuged at 100g for 5 minutes. Floating protoplasts, forming a ring between two layers of W5 and sucrose solutions, were collected by sterile Pasteur pipette and diluted in the W5 solution (Menczel et al., 1981) and centrifuged at 100 g for 5 minutes.
Protoplasts, intended for fusion experiments were after supernatant removal finally resuspended in 0.1–0.5 ml of M+C medium, suspensions of mesophyll and hypocotyl protoplasts were then mixed in the ratio of 1 : 1 and the density was adjusted to 1–2 × 105 protoplasts per 1 ml. 3 × 50 μl (3 drops) of the protoplast suspension was added to the 35 mm Petri dish and sedimented for 20 minutes. Polyethylene glycol solution (PEG) was gently added to each drop of sedimented protoplasts and incubated for 15 or 20 minutes. Three different concentrations of PEG 6000 (Molecular weight) were used separately (20%, 25% or 30%) for each set of experiments. The PEG solution was carefully removed and 200 l of STOP solution was added to each drop. After 20 minutes of incubation the STOP solution was replaced by 0.5 ml of liquid cultivation medium B.
Protoplast cultivation
Protoplasts after isolation, purification and, eventually after fusion experiments were cultured in the liquid medium B (Pelletier et al., 1983), containing 0.25 mg/l 2.4-D, 1 mg/l NAA, 1 mg/l BAP, 2% glucose, pH 5.8 at the density of 2.0 × 104/ml. Petri dishes with protoplast suspension were sealed with Parafilm and incubated in the dark in a thermostat at 25°C. Low osmotic medium C (Pelletier et al., 1983) without 2.4- D was added in amount 0.5 ml per each Petri dish containing medium B. Medium C was added twice every third day. After three weeks of cultivation in the dark, cultures were transferred to a cultivation room and further maintained under controlled environmental conditions (25°C and 16/8h day/night photoperiod and light intensity 260 μmol/m2/s). When microcalli reached the size of 0.5–1.0 mm in diameter, they were transferred to solid induction medium E (Pelletier et al., 1983). The microcalli (calli with typical prolonged cells) formation frequency was calculated by the number of microcalli formed to the total number of protoplasts cultivated.
Plant regeneration
After the growth period of approximately 15 days on the solid E medium calli reached the size of 5–10 mm in diameter. Well-developed calli were transferred to the regeneration medium F (Pelletier et al., 1983) to form shoots. Well-formed shoots were subsequently transferred to MS regeneration medium (Murashige and Skoog, 1962) without growth regulators. After a culture period of 1–2 months on hormone free medium most shoots regenerated roots and were transferred to soil and gradually adapted to a greenhouse environment.
Analysis of data
To prepare the sets of measured values for the analysis of variance (i.e. to follow normal distribution of errors), the percentage data was converted via square-root transformation (Bartlett 1936). Analytic software STATISTICA (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA) was used for both data analysis and the preparation of graph

Kết quả (Việt) 1:

Vật LIỆU VÀ phương PHÁP Plantmaterial Cao năng suất tăng gấp đôi bội (DH) dòng mùa đông oilseed hiếp dâm (Brassica napus L.) như là một nguồn của các protoplasts 01 tháng OP BN và BN-SL-03/04 và các kiểu gen của mù tạc Ethiopia (Brassica carinata A. Braun)-DH dòng BC Dodolla và nguyên vật liệu giống BC-1 và BC-6-như là một nguồn của hypocotyl protoplasts đã được sử dụng cho các thí nghiệm. Để có được vô trùng vật liệu cho việc xây dựng nền văn hóa protoplast, hạt giống ở trên đã đề cập kiểu gen là bề mặt bột trong 70% ethanol trong một phút, tiếp theo ngâm trong 30% thương mại bleach Savo (trên cơ sở NaClO) cho hai mươi phút và cuối cùng bằng cách rửa thủ tục với vô trùng nước cất ba lần. MS trung bình mà không cần điều chỉnh tăng trưởng đã được sử dụng cho nảy mầm cây giống. Các hạt giống của kiểu gen dành cho hypocotyl protoplasts đã được ủ trong một nhiệt ở 25° C trong bóng tối; cho các protoplasts đã được giữ trong một căn phòng trồng trọt và được trồng trong điều kiện môi trường kiểm soát (25° C và 16 / 8h ngày/đêm photoperiod và cường độ ánh sáng 260 μmol/m2/s). Protoplast cô lập và tổng hợp 7 - day old hypocotyls và lá từ cây trồng trong ống nghiệm một tháng tuổi đã được cắt thành các phân đoạn 1mm và điều trị một cách riêng biệt trong món ăn Petri khác nhau với các giải pháp enzym có chứa 0,25% macerozyme R10 (Serva) và 1% cellulase Onozuka R 10 (Serva) trong dung dịch muối W5 (Potrykus và Shillito, năm 1986, Mukhopadhyay et al., 1994). Mô cắt ủ cho 18 giờ trong một nhiệt ở 25° C mà không run rẩy. Hỗn hợp ủ được lọc riêng rẽ qua một lưới nylon 50 μm và chuyển 10 ml máy ly tâm ống. Đình chỉ bị ly 100 g trong 5 phút. Sau khi cẩn thận loại bỏ supernatant, 4 ml 20% sucrose giải pháp hỗn hợp với hệ thống treo protoplast và sau đó nhẹ nhàng phủ 2 ml dung dịch muối W5 không phải lo việc đình chỉ protoplast. Đình chỉ đã một lần nữa ly 100 g trong 5 phút. Protoplasts nổi, tạo thành một vòng giữa hai lớp W5 Sucroza giải pháp đã được thu thập bởi vô trùng Pasteur pipette và pha loãng trong dung dịch W5 (Menczel và ctv., 1981) và ly 100 g trong 5 phút. Protoplasts, dành cho thí nghiệm tổng hợp sau khi loại bỏ supernatant cuối cùng resuspended trong 0,1-0,5 ml M + C vừa, đình chỉ các và hypocotyl protoplasts đã được sau đó pha trộn theo tỉ lệ 1: 1 và mật độ đã được điều chỉnh để 1 – 2 × 105 protoplasts mỗi 1 ml. 3 × 50 μl (3 giọt) của hệ thống treo protoplast đã được thêm vào món ăn Petri 35 mm và sedimented trong 20 phút. Giải pháp polyethylene glycol (PEG) nhẹ nhàng thêm vào mỗi thả sedimented protoplasts và ủ trong 15 hay 20 phút. 3 Các nồng độ khác nhau của PEG 6000 (trọng lượng phân tử) đã được sử dụng một cách riêng biệt (20%, 25% hoặc 30%) cho mỗi tập hợp các thí nghiệm. PEG giải pháp đã được gỡ bỏ một cách cẩn thận và 200 l DỪNG giải pháp đã được thêm vào mỗi thả. Sau 20 phút ấp các giải pháp ngăn CHẶN được thay thế bằng cách 0.5 ml chất lỏng trồng vừa sinh Protoplast trồng Protoplasts sau khi bị cô lập, thanh lọc, và cuối cùng sau khi thí nghiệm nhiệt hạch đã được nuôi cấy trong B vừa lỏng (Pelletier et al., 1983), có chứa 0,25 mg/l 2,4-D, 1 mg/l NAA, 1 mg/l BAP, 2% glucose, pH 5.8 ở mật 2.0 x 104 / ml. Petri món ăn với protoplast hệ thống treo được niêm phong với Parafilm và ủ trong bóng tối trong một nhiệt ở 25° C. Thấp osmotic trung bình C (Pelletier và ctv., 1983) mà không có 2,4-D đã được thêm vào số tiền cách 0.5 ml cho mỗi món ăn Petri chứa vừa sinh trung bình C đã được bổ sung hai lần mỗi ngày thứ ba. Sau 3 tuần nuôi trồng trong bóng tối, nền văn hóa đã được chuyển giao cho một phòng trồng trọt và tiếp tục duy trì các điều kiện kiểm soát môi trường (25° C và 16 / 8h ngày/đêm photoperiod và cường độ ánh sáng 260 μmol/m2/s). Khi microcalli đạt đến kích thước của 0.5-1.0 mm ở đường kính, họ được chuyển đến rắn cảm ứng vừa E (Pelletier và ctv., 1983). Tần số hình thành microcalli (calli với điển hình kéo dài các tế bào) được tính bằng số microcalli được hình thành với tổng số protoplasts được trồng. Thực vật tái tạo Sau khi sự phát triển thời gian khoảng 15 ngày trên rắn E vừa calli đạt đến kích thước của đường kính 5-10 mm. Phát triển tốt calli được chuyển sang phương tiện tái sinh F (Pelletier và ctv., 1983) để các cành mẫu đơn. Bài được hình thành các cành được chuyển sau đó mà không có sự tăng trưởng cơ quan quản lý cho MS phương tiện tái sinh (Murashige và Skoog, 1962). Sau một giai đoạn văn hóa về nội tiết tố là 1-2 tháng miễn phí bắn tầm trung nhất tái sinh rễ và đã chuyển sang đất và dần dần thích nghi với một môi trường nhà kính. Phân tích dữ liệu Để chuẩn bị các tập hợp của các giá trị đo cho phân tích các phương sai (tức là để làm theo phân phối bình thường lỗi), dữ liệu tỷ lệ phần trăm được chuyển qua căn bậc hai – chuyển đổi (Bartlett 1936). Phân tích phần mềm STATISTICA (StatSoft, Inc, Tulsa, OK, MỸ) đã được sử dụng để phân tích dữ liệu và chuẩn bị đồ thị

Kết quả (Việt) 2:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Plantmaterial
cao năng suất tăng gấp đôi đơn bội (DH) dòng mùa đông hạt cải dầu (Brassica napus L.) là một nguồn tế bào trần diệp nhục BN-OP-01 và BN-SL-03/04 và kiểu gen của mù tạt Ethiopia (Brassica carinata Một . Braun) - dòng DH BC Dodolla và vật liệu nhân giống BC-1 và BC-6 - như là một nguồn tế bào trần hypocotyl đã được sử dụng cho các thí nghiệm. Để có được nguyên liệu thực vật vô trùng cho việc thiết lập nền văn hóa kiểu mẫu đầu tiên, hạt giống của các kiểu gen nói trên đã được khử trùng bề mặt trong 70% ethanol trong một phút, sau đó ngâm trong 30% thuốc tẩy thương mại Savo (trên cơ sở NaClO) cho hai mươi phút và cuối cùng của quy trình giặt với vô trùng nước cất ba lần. Môi trường MS không có điều hòa sinh trưởng được sử dụng cho sự nảy mầm của cây con. Hạt giống của các kiểu gen dành cho bào trần hypocotyl được ủ trong một nhiệt ở 25 ° C trong bóng tối; những người cho tế bào trần diệp nhục đã được lưu giữ trong một căn phòng trồng trọt và canh tác trong điều kiện môi trường có kiểm soát (25 ° C và 16 / 8h ngày / đêm chiếu sáng và cường độ ánh sáng 260 mmol / m2 / s).
Cô lập nguyên hình và fusion
Bảy ngày thân mầm cũ và lá từ trong ống nghiệm cây một tháng- già bị cắt thành các đoạn 1mm và xử lý riêng trong đĩa Petri khác nhau với các giải pháp enzyme, có chứa 0,25% macerozyme R10 (Serva) và 1% cellulase Onozuka R 10 (Serva) trong dung dịch muối W5 (Potrykus và Shillito, 1986, Mukhopadhyay et al., 1994). Mô Cut được ủ trong 18 giờ ở một nhiệt ở 25 ° C mà không run rẩy. Hỗn hợp ủ đã được lọc riêng biệt thông qua một lưới nylon 50 micron và chuyển giao cho 10 ml ống ly tâm. Hệ thống treo được ly tâm ở 100g trong 5 phút. Sau khi loại bỏ bề cẩn thận, 4 ml dung dịch sucrose 20% được trộn với hệ thống treo kiểu mẫu đầu tiên và sau đó nhẹ nhàng bao phủ với giải pháp W5 muối 2 ml mà không làm ảnh hưởng đến hệ thống treo kiểu mẫu đầu tiên. Hệ thống treo được một lần nữa ly tâm 100g trong 5 phút. Nổi bào trần, tạo thành một vòng giữa hai lớp W5 và giải pháp sucrose, được thu thập bằng pipette Pasteur vô trùng và pha loãng trong dung dịch W5 (Menczel et al., 1981) và ly tâm ở 100 g trong 5 phút.
Tế bào trần, dành cho các thí nghiệm phản ứng tổng hợp là sau khi loại bỏ nổi cuối cùng lơ lửng trong 0,1-0,5 ml M + C trung bình, hệ thống treo của diệp nhục và hypocotyl bào trần sau đó được trộn theo tỉ lệ 1: 1 và mật độ được điều chỉnh 1-2 × 105 bào trần mỗi 1 ml. 3 × 50 ml (3 giọt) của hệ thống treo kiểu mẫu đầu tiên đã được thêm vào các món ăn 35 mm Petri và lắng lại trong 20 phút. Giải pháp polyethylene glycol (PEG) đã được nhẹ nhàng thêm vào mỗi giọt bào trần lắng lại và ủ trong 15 hoặc 20 phút. Ba nồng độ khác nhau của PEG 6000 (trọng lượng phân tử) đã được sử dụng riêng rẽ (20%, 25% hoặc 30%) cho mỗi bộ thí nghiệm. Các giải pháp PEG đã được gỡ bỏ một cách cẩn thận và 200 l dung dịch DỪNG đã được thêm vào từng giọt. Sau 20 phút ủ giải pháp DỪNG đã được thay thế bằng 0,5 ml môi trường canh lỏng B.
trồng nguyên hình
tế bào trần sau khi cách ly, lọc và, cuối cùng sau khi thí nghiệm phản ứng tổng hợp được nuôi cấy trong môi trường B lỏng (Pelletier et al., 1983), có chứa 0.25 mg / l 2,4-D, 1 mg / l NAA 1 mg / l BAP, 2% glucose, pH 5,8 ở mật độ 2,0 × 104 / ml. Petri món ăn với hệ thống treo kiểu mẫu đầu tiên đã được niêm phong với Parafilm và ủ trong bóng tối ở một nhiệt ở 25 ° C. Thấp thẩm thấu trung C (Pelletier et al., 1983) mà không 2.4- D đã được bổ sung vào lượng 0,5 ml cho mỗi đĩa Petri chứa môi trường B. Medium C đã được bổ sung hai lần mỗi ngày thứ ba. Sau ba tuần trồng trong bóng tối, các nền văn hóa đã được chuyển giao cho một phòng trồng trọt và tiếp tục duy trì trong điều kiện môi trường có kiểm soát (25 ° C và 16 / 8h ngày / đêm chiếu sáng và cường độ ánh sáng 260 mmol / m2 / s). Khi microcalli đạt kích thước từ 0,5-1,0 mm đường kính, họ đã chuyển sang cảm ứng rắn vừa E (Pelletier et al., 1983). Các microcalli (mô sẹo với các tế bào kéo dài điển hình) tần số hình đã được tính toán bằng của số microcalli thành lập với tổng số tế bào trần canh tác.
Nhà máy tái tạo
Sau giai đoạn tăng trưởng khoảng 15 ngày trên E mô sẹo môi trường rắn đạt kích thước 5-10 mm đường kính. Mô sẹo phát triển tốt được chuyển vào môi trường tái sinh F (Pelletier et al., 1983) để hình thành chồi. Chồi tốt được hình thành sau đó được chuyển giao cho MS tái sinh trung bình (Murashige và Skoog, 1962) mà không điều hòa sinh trưởng. Sau một thời gian nuôi 1-2 tháng trên hormone vừa tự do nhất bắn rễ tái sinh và đã được chuyển vào đất và dần dần thích nghi với một môi trường hiệu ứng nhà kính.
Phân tích các dữ liệu
để chuẩn bị các bộ giá trị đo để phân tích phương sai (tức là theo phân phối chuẩn của lỗi), các dữ liệu phần trăm đã được chuyển qua chuyển vuông gốc (Bartlett 1936). Phân tích phần mềm Statistica (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA) được sử dụng cho cả hai phân tích dữ liệu và chuẩn bị các đồ thị