Materials and methodsPreparation of

Materials and methods

Preparation of the viral inoculum

Naturally WSSV-infected adult shrimp (M. japonicus) with the prominent signs of disease with white spots in the carapace were collected from culture ponds from shrimp farms, Japan. They were used as the source of the virus to develop the real-time LAMP diagnostic method. Adult shrimp were transported on dry ice and stored in separate packs at −80°C in the laboratory. Frozen infected specimens were thawed and homogenized in a sterile homogenizer using a 10% (w/v) suspension in NTE buffer (0·2 mol l−1 NaCl, 0·02 mol l−1 Tris–HCl and 0·02 mol l−1 EDTA, pH 7·4). The homogenate was centrifuged at 4000 g for 20 min at 4°C; the supernatant was again clarified at 10 000 g for 10 min at 4°C; and then the final supernatant was filtered through a 0·45 μm membrane. The filtrate was then stored at −20°C before extraction of nucleic acids for development and standardization of the real-time LAMP method.
DNA extraction

Extraction of DNA was performed from the virus homogenates prepared above. From each sample, 200 μl of the homogenate was added to 600 μl of DNAzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and further steps were carried out according to the manufacturer’s instructions. Extracted DNA samples were quantified spectrophotometrically at 260 nm and the presence of WSSV was confirmed using the conventional PCR method (Takahashi et al. 1996) before storing at −20°C.

Primers for WSSV real-time LAMP

Real-time LAMP primers for WSSV were designed using the published sequence of the WSSV-ORF36 gene (GenBank accession number: AF369029) with the LAMP primer designing software Primer Explorer version 4 (http://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/index.html). A set of six primers: two outer (F3 and B3), two inner (FIP and BIP) and two loop primers (FL and BL) were designed according to the manufacturer’s instructions where the combined primer set helps in strand displacement (

Kết quả (Việt) 1:

Vật liệu và phương phápChuẩn bị inoculum virusTự nhiên nhiễm WSSV dành cho người lớn tôm (M. japonicus) với những dấu hiệu nổi bật của bệnh với các đốm trắng trong mai được thu thập từ văn hóa hồ nước từ trang trại tôm, Nhật bản. Chúng được sử dụng như là nguồn gốc của vi rút để phát triển các phương pháp chẩn đoán đèn thời gian thực. Dành cho người lớn tôm được vận chuyển trên đá khô và được lưu trữ trong các gói riêng biệt −80 ° C trong phòng thí nghiệm. Mẫu vật bị nhiễm bệnh đông lạnh xả đá và homogenized trong một homogenizer vô trùng bằng cách sử dụng một hệ thống treo 10% (w/v) trong vùng đệm NTE (0·2 mol l−1 NaCl, 0·02 mol l−1 Tris-HCl và 0·02 mol l−1 EDTA, pH 7·4). Homogenate ly 4000 g cho 20 phút tại 4° C; supernatant đã làm rõ một lần nữa 10 000 g cho 10 phút ở 4 ° C; và sau đó supernatant cuối cùng đã được lọc qua một màng μm 0·45. Filtrate sau đó được lưu trữ ở nhiệt độ-20 ° C trước khi khai thác các axit nucleic cho phát triển và tiêu chuẩn của các phương pháp thời gian thực của đèn.Khai thác DNAKhai thác của DNA được thực hiện từ virus homogenates chuẩn bị ở trên. Từ mỗi mẫu 200 μl homogenate đã được bổ sung 600 μl hoá DNAzol (Invitrogen, Carlsbad, California, Hoa Kỳ) và tiếp tục bước đã được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trích xuất các mẫu DNA đã được định lượng spectrophotometrically tại 260 nm và sự hiện diện của WSSV được xác nhận bằng cách sử dụng các phương pháp PCR thông thường (Takahashi et al. 1996) trước khi lưu trữ ở nhiệt độ-20 ° C.Lớp lót cho các WSSV real-time đènThời gian thực với đèn chất nền, mồi cho WSSV được thiết kế bằng cách sử dụng chuỗi gen WSSV-ORF36, được xuất bản (GenBank nhập số: AF369029) với mồi đèn thiết kế phần mềm mồi Explorer phiên bản 4 (http://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/index.html). Bộ của mồi sáu: hai bên ngoài (F3 và B3), hai bên trong (FIP và BIP) và vòng hai lớp lót (FL và BL) được thiết kế theo hướng dẫn của nhà sản xuất mà kết hợp mồi sẽ giúp thiết lập ở strand thuyên ()

Kết quả (Việt) 2:

Vật liệu và phương pháp

chuẩn bị ổ bệnh virus

nhiên tôm lớn WSSV nhiễm (M. japonicus) với những dấu hiệu nổi bật của bệnh với những đốm trắng ở mai đã được thu thập từ các ao nuôi từ các trang trại nuôi tôm, Nhật Bản. Chúng được sử dụng như là nguồn gốc của virus để phát triển theo thời gian thực ĐÈN phương pháp chẩn đoán. Tôm trưởng thành được vận chuyển trên băng khô và được lưu trữ trong các gói riêng biệt ở -80 ° C trong phòng thí nghiệm. Mẫu nhiễm đông lạnh được giải đông và đồng nhất trong một đồng hóa vô trùng bằng 10% (w / v) treo trong NTE đệm (0 · 2 mol l-1 NaCl, 0 · 02 mol l-1 Tris-HCl và 0 · 02 mol l -1 EDTA, pH 7 · 4). Các đồng chất được ly tâm ở 4000 g trong 20 phút ở 4 ° C; phù nổi được nữa làm rõ tại 10 000 g trong 10 phút ở 4 ° C; và sau đó gạn thức đã được lọc qua một lớp màng 0 · 45 micron. Dịch lọc sau đó được bảo quản ở -20 ° C trước khi khai thác của các axit nucleic cho sự phát triển và tiêu chuẩn của thời gian thực ĐÈN phương pháp.
Chiết DNA

chiết DNA đã được thực hiện từ homogenates rút chuẩn bị ở trên. Từ mỗi mẫu, 200 ml của đồng chất được thêm vào 600 ml DNAzol thuốc thử (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) và các bước tiếp theo được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Mẫu DNA chiết xuất được định lượng spectrophotometrically tại 260 nm và sự hiện diện của WSSV đã được xác nhận bằng cách sử dụng phương pháp PCR thông thường (Takahashi et al., 1996) trước khi lưu trữ ở -20 ° C.

Sơn lót dùng cho WSSV thời gian thực ĐÈN

mồi ĐÈN thời gian thực cho WSSV được thiết kế sử dụng các trình tự công bố của gen WSSV-ORF36 (GenBank số truy cập: AF369029) với các phần mềm thiết kế ĐÈN mồi Primer Explorer phiên bản 4 (http://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/index.html). Một bộ sáu mồi: hai bên ngoài (F3 và B3), hai bên (FIP và BIP) và hai mồi vòng lặp (FL và BL) được thiết kế theo hướng dẫn của nhà sản xuất, nơi tập mồi kết hợp giúp trong sợi dịch chuyển (