Spain (Allen and Ball, 1995), Germa

Spain (Allen and Ball, 1995), Germany (Siede
and Büchler, 2003), France (Gauthier et al.,
2003), India (Allen and Ball, 1996), Fiji (Allen
and Ball, 1996), Australia and New Zealand
(Hornitzky, 1981; Anderson, 1983; Hornitzky,
1987; Anderson, 1988; Todd and Ball, 2003).
Distinct sources of KBV have been isolated
in different parts of the world, distinguishable
from one another by comparison of the coat
protein (Allen and Ball, 1995).
The aim of this work was to carry out a survey
of hives in England and Wales to ascertain
the status of KBV. Real-time PCR primers
and a probe were designed for the specific detection
of KBV and to amplify the 18S rRNA
gene from the honey bee host for use as an internal
positive control. An automated extraction
method, based on the use of silica coated
paramagnetic beads was developed to offer
more rapid screening of large numbers of bees.
2. MATERIALS AND METHODS
2.1. Viral samples
Purified KBV isolates were obtained from different
locations and insect species. Isolate KBV 14
(from honey bee in Australia, exact location unknown)
16 (from bumble bee in Auckland, New
Zealand) and KBV NZ (from honey bee in Auckland,
New Zealand). Other purified virus preparations
and virus infected bees and pupae were supplied
by Rothamsted Research (UK), USDA (America)
and HDLGN (Germany). Infected bee samples
were transported at ambient temperatures in 70%
ethanol, and stored at –20 ˚C before analysis.
2.2. Real-time PCR primer
and TaqMan
probe design
Sequence data for coat protein genes from
KBV and the closely related Acute paralysis
virus (ABPV) were downloaded from the EMBL
database to compare inter and intra viral sequence
variability. Multiple sequence alignments
were carried out using the CLUSTAL V algorithm
in the package MegAlign (DNASTAR inc.,
Madison, USA). Real-time PCR primers and a
probe were designed (Primer ExpressTM software,
Applied Biosystems, Branchburg, USA) to a region
of sequence (using accession AF263725) conserved
in KBV but distinct from ABPV. The assay
was tested for cross-reaction against ABPV and the
other bee viruses Black queen cell virus (BQCV),
Sacbrood virus (SBV), Cloudy wing virus (CWV),
Slow paralysis virus (SPV), Deformed wing virus
(DWV), Chronic paralysis virus (CPV) and Apis iridescent
virus (AIV).
Real-time PCR primers and a probe were designed
to the bee 18S rRNA gene of Apis mellifera
(AJ307465) to serve as an internal positive control
(IPC) for assessing nucleic acid extraction effi-
ciency. The 5’ terminal reporter dyes for the probes
were 6-carboxyflurorescin (FAM) and JOETM and
the 3’ quencher was tetra-methylcarboxyrhodamine
(TAMRA) (Tab. I).
2.3. Survey of colonies for KBV
in England and Wales
Adult honey bees were collected from colonies
throughout England and Wales; samples were collected
by Appointed Bee Inspectors and individual
First detection of Kashmir bee virus in the UK 183
beekeepers. Samples were taken from both healthy
and unhealthy hives. All bee samples were placed
directly in 40 mL polypropylene universal bottles
containing 25 mL of 70% ethanol and stored at 4 oC
prior to testing.
2.4. Tissue homogenisation
The non survey samples were tested individually
whilst the survey samples were tested by bulking
5 bees together for each sample, such that larger
number of bees could be tested from each hive.
Non-survey samples: individual bees/wasps were
placed inside 2 mL screw cap micro-centrifuge
tubes with 3 tungsten carbide beads (3 mm) (Qiagen
Ltd, Crawley, UK) and 1 mL of lysis buffer (ThermoLabsystems,
Vantaa, Finland); the tubes were
mounted onto a mixer mill (Qiagen) and shaken
at an amplitude of 30/s for 3 minutes. The tubes
were centrifuged at 6000 g (room temperature) for
3 min to remove debris. UK survey samples: for
the survey samples, two replicates each containing
5 bees, were processed per survey sample. Excess
ethanol was removed from all bees by blotting
on paper towel. Each replicate of 5 bees were
placed in a 100 mm × 150 mm filter grinding bag
(Bioreba, Reinach, Germany) with 5 mL of lysis
buffer (Thermo Labsystems) and ground manually
with a Homex grinder (Bioreba). The lysate was decanted
into a 5 mL screw cap tube. Tubes were spun
at 6000 g for 1 min to pellet debris.
2.5. RNA extraction from Bees
RNA was extracted from the cleared lysate
using a silica-based total RNA extraction kit
(Thermo Labsystems) in conjunction with a magnetic
particle processor (Kingfisher ML, Thermo
Labsystems). The manufacturer’s program ‘Total_RNA_ML_1’
was used. Briefly, Kingfisher
tubes were prepared as follows – tube 1: 1000 µL
of cleared lysate and 50 µL of MagnaSil beads
(Promega); tube 2: 600 µL of lysis buffer b
(Promega); tubes 3 and 4: 1 mL of 70% ethanol;
tube 5: 200 µL of molecular grade sterile water
(BDH, Lutterworth, UK). The resulting RNA eluted
into tube 5 was transferred to a fresh 1.5 mL tube
and stored at –20 ˚C prior to use.
2.6. Real-time PCR assays
All assays were run as simplex assays. Reactions
were set up in either 96 or 384 well reaction
plates using PCR core reagent kits (Applied Biosystems),
following the protocols supplied, but with the
addition of 0.5 units of M-MLV reverse transcriptase
(Promega) per reaction. For each reaction, 1 µL
of total RNA was added, giving a final volume of
25 µL. Plates were then cycled at generic system
conditions (48 ˚C/30 min, 95 ˚C/10 min and 40 cycles
of 60 ˚C/1 min, 95 ˚C/15 s) within the 7900 HT
Sequence Detection System (Applied Biosystems),
using real-time data collection.
2.7. Cloning and sequencing PCR
products
Real-time PCR products were directly ligated
into plasmid pGEM
-T Easy Vector (Promega),
and transformed into E. coli JM109 High Effi-
ciency competent cells (Promega) following the
manufacturer’s protocols. White bacterial colonies
containing plasmids with inserts were selected and
plasmid DNA was purified using the Wizard
Plus
SV miniprep DNA purification system (Promega).
Purified plasmid concentrations were adjusted to
20 ng µL−1 for sequencing. Sequencing was carried
out by the DNAseq sequencing service, University
of Dundee, Scotland.
2.8. Quantification of KBV virus load in
bees
The KBV and bee IPC real-time PCR assays
were used to quantify KBV virus load in positive
UK samples using a relative standard curve
method (User Bulletin 2, Applied Biosystems). For
this method, standard dilutions were prepared from
RNA extracted from a purified KBV preparation
(KBV 14) and from bees collected from the CSL
apiary. Each standard was diluted through five levels
of a two-fold dilution series. The standard dilutions
were tested alongside the UK KBV positive
RNA samples, and for comparison, alongside RNA
extracted from Australian bees known to be naturally
infected with high levels of KBV or covertly
infected (Dennis Anderson personal communication).
Standard curves were constructed for KBV
and bee IPC by plotting the log of each standard
dilution verses the TaqMan
Ct value (threshold cycle
at which the first PCR products were detected).

Kết quả (Việt) 1:

Tây Ban Nha (Allen và bóng, 1995), Đức (Siedevà Büchler, 2003), Pháp (Gauthier et al.,Năm 2003), Ấn Độ (Allen và bóng, 1996), Phi-gi (Allenvà bóng, 1996), Úc và New Zealand(Hornitzky, 1981; Anderson, 1983; Hornitzky,năm 1987; Anderson, 1988; Todd và bóng, 2003).Khác biệt nguồn KBV đã bị cô lậptrong các bộ phận khác nhau của thế giới, phân biệttừ nhau bằng cách so sánh của áoprotein (Allen và bóng, 1995).Mục đích của việc này là để thực hiện một cuộc khảo sátcủa phát ban ở Anh và xứ Wales để xác địnhtrạng thái KBV. Thời gian thực Đảng Cộng sản Romania lớp lótmột thăm dò được thiết kế để phát hiện các cụ thểKBV và khuyếch đại 18S rRNAgen từ các máy chủ con ong mật ong để sử dụng như một nội bộtích cực điều khiển. Một khai thác tự độngphương pháp, dựa trên việc sử dụng của silica trángthuận từ hạt đã được phát triển để cung cấpkiểm tra nhanh hơn số lượng ong lớn.2. TÀI LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP2.1. virus mẫuTinh khiết KBV chủng đã thu được từ khác nhauđịa điểm và các loài côn trùng. Cô lập KBV 14(từ mật ong ong ở Úc, chính xác vị trí không rõ)16 (từ con ong kêu vo vo ở Auckland, mớiZealand) và New Zealand KBV (từ mật ong ong ở Auckland,New Zealand). Chuẩn bị tinh khiết virus khácvà nhiễm vi rút ong và nhộng đã được cung cấpbởi Rothamsted nghiên cứu (Anh), USDA (Mỹ)và HDLGN (Đức). Ong bị nhiễm mẫuđã được vận chuyển ở các nhiệt độ môi trường xung quanh trong 70%ethanol, và được lưu trữ tại –20 ˚C trước khi phân tích.2.2. thời gian thực Đảng Cộng sản Romania mồivà TaqMan thăm dò thiết kếTrình tự dữ liệu cho áo protein gen từKBV và tê liệt cấp tính liên quan chặt chẽvirus (ABPV) đã được tải về từ EMBLcơ sở dữ liệu để so sánh liên và nội virus Chuỗibiến đổi. Nhiều thứ tự sắp xếpđã được thực hiện bằng cách sử dụng các thuật toán CLUSTAL Vtrong gói MegAlign (DNASTAR inc.,Madison, Mỹ). Thời gian thực Đảng Cộng sản Romania chất nền, mồi và mộtthăm dò đã được thiết kế (mồi ExpressTM phần mềm,Áp dụng Biosystems, Branchburg, Hoa Kỳ) đến một khu vựccác chuỗi (sử dụng gia nhập AF263725) bảo tồnở KBV nhưng riêng biệt từ ABPV. Các khảo nghiệmđã được thử nghiệm cho cross-reaction chống lại ABPV và cácnữ hoàng ong virus khác đen di động virus (BQCV),Sacbrood virus (NHNN), mây cánh virus (CWV),Chậm tê liệt virus (SPV), Deformed cánh virus(DWV), tình trạng tê liệt mãn tính virus (CPV) và API óng ánhvirus (AIV).Thời gian thực Đảng Cộng sản Romania chất nền, mồi và thăm dò một được thiết kếđể con ong 18S rRNA gene của API mellifera(AJ307465) để phục vụ như là một điều khiển tích cực nội bộ(IPC) để đánh giá nucleic acid khai thác thống -ciency. Các 5' phóng viên nhà ga thuốc nhuộm cho các đầu dòđã là 6-carboxyflurorescin (FAM) và JOETM và3' quencher là tetra-methylcarboxyrhodamine(TAMRA) (Tab. I).2.3. cuộc khảo sát của các thuộc địa cho KBVở Anh và xứ WalesDành cho người lớn mật ong ong được thu thập từ thuộc địatrong suốt cả Anh và xứ Wales; mẫu đã được thu thậpbởi bổ nhiệm làm thanh tra ong và cá nhânCác phát hiện đầu tiên của Kashmir ong virus ở Anh 183người nuôi ong. Mẫu đã được thực hiện từ cả hai khỏe mạnhvà phát ban không lành mạnh. Tất cả ong mẫu được đặttrực tiếp trong 40 mL chai phổ quát polypropylenecó 25 mL 70% ethanol và được lưu trữ tại 4 oCtrước khi thử nghiệm.2.4. mô LuMẫu phòng không khảo sát đã được thử nghiệm cá nhântrong khi các mẫu khảo sát đã được thử nghiệm bởi bulking5 con ong cùng nhau cho mỗi mẫu, sao cho lớn hơnsố lượng ong có thể được kiểm tra từ mỗi tổ ong.Phòng Không-khảo sát mẫu: cá nhân ong/ong bắp càyĐặt bên trong 2 mL vít cap vi-máy ly tâmống với 3 cacbua vonfram hạt (3 mm) (QiagenLtd, Crawley, Vương Quốc Anh) và 1 mL lysis đệm (ThermoLabsystems,Vantaa, Phần Lan); Các ốnggắn vào nhà máy trộn (Qiagen) và rung độngtại một biên độ của 30/s trong 3 phút. Các ốngđã ly 6000 g (nhiệt độ phòng) cho3 phút để loại bỏ mảnh vụn. UK khảo sát mẫu: choCác mẫu khảo sát, hai sao chép mỗi chứa5 ong, đã được xử lý một cuộc khảo sát mẫu. Dư thừaethanol đã được gỡ bỏ từ tất cả các con ong bởi thấmtrên khăn giấy. Mỗi replicate 5 ong đãĐặt trong một bộ lọc 100 mm × 150 mm mài túi(Bioreba, Reinach, Đức) với 5 mL lysisđệm (nhiệt Labsystems) và mặt đất theo cách thủ côngvới một máy xay Homex (Bioreba). Các lysate decantedvào một ống trục vít cap 5 mL. Ống được tách6000 g cho 1 phút để pellet mảnh vỡ.2.5. RNA khai thác từ ongRNA được chiết xuất từ các xóa lysatebằng cách sử dụng một silica dựa trên tất cả RNA khai thác bộ(Nhiệt Labsystems) kết hợp với một từbộ xử lý hạt (Sả ML, nhiệtLabsystems). Chương trình của nhà sản xuất 'Total_RNA_ML_1'được sử dụng. Một thời gian ngắn, Sảống đã được chuẩn bị như sau-ống 1: 1000 mlcủa xóa lysate và 50 ml của MagnaSil hạt(Promega); ống 2: 600 ml của lysis đệm b(Promega); ống 3 và 4: 1 mL 70% ethanol;ống 5: 200 ml nước vô trùng lớp phân tử(BDH, Lutterworth, Vương Quốc Anh). RNA kết quả elutedvào ống 5 được chuyển đến một ống tươi 1.5 mLvà được lưu trữ tại –20 ˚C trước khi sử dụng.2.6. thời gian thực Đảng Cộng sản Romania thử nghiệmTất cả các thử nghiệm đã được điều hành như simplex thử nghiệm. Phản ứngđược xây dựng trong 96 hoặc 384 phản ứng tốttấm sử dụng PCR lõi bộ dụng cụ tinh khiết (áp dụng Biosystems),sau các giao thức được cung cấp, nhưng với cácbổ sung vị cách 0.5 M-MLV ngược(Promega) cho một phản ứng. Cho mỗi phản ứng, 1 mlTổng số RNA được bổ sung, cho một khối lượng cuối cùng của25 ml. tấm sau đó đã cycled tại hệ thống chungđiều kiện (48 ˚C/30 phút, 95 ˚C/10 phút và 40 chu kỳ60 ˚C/1 min, 95 ˚C/15 s) trong vòng 7900 HTTrình tự phát hiện hệ thống (áp dụng Biosystems),thu thập dữ liệu thời gian thực bằng cách sử dụng.2.7. nhân bản và xác định trình tự PCRsản phẩmThời gian thực Đảng Cộng sản Romania sản phẩm trực tiếp được ligatedvào plasmid pGEM -T dễ dàng Vector (Promega),và chuyển thành E. coli JM109 cao thống-ciency có thẩm quyền (Promega) sau các tế bào cácgiao thức của nhà sản xuất. Trắng thuộc địa do vi khuẩnPlasmid có chứa với phụ trang đã được lựa chọn vàplasmid DNA được tinh chế bằng cách sử dụng các thuật sĩ PlusSV miniprep DNA thanh lọc hệ thống (Promega).Nồng độ tinh khiết plasmid đã được điều chỉnh để20 µL−1 ng cho trình tự. Trình tự đã được thực hiệnra bởi dịch vụ trình tự DNAseq, đại họcDundee, Scotland.2.8. định lượng KBV virus tải trongongKBV và ong IPC thời gian thực PCR thíđã được sử dụng để định lượng KBV virus tải trong tích cựcUK mẫu bằng cách sử dụng một đường cong tiêu chuẩn tương đốiphương pháp (người dùng bản tin 2, Biosystems áp dụng). Chophương pháp này, tiêu chuẩn dilutions đã được chuẩn bị từRNA được chiết xuất từ một sự chuẩn bị tinh khiết KBV(KBV 14) và từ ong thu thập từ CSLapiary. Mỗi tiêu chuẩn được pha loãng thông qua năm cấp độmột loạt các pha loãng hai lần. Dilutions tiêu chuẩnđã được thử nghiệm cùng với KBV UK tích cựcRNA mẫu, và để so sánh, cùng với RNAchiết xuất từ Úc ong được biết đến là tự nhiênbị nhiễm bệnh với mức độ cao của KBV hoặc tênbị nhiễm (Dennis Anderson cá nhân thông tin liên lạc).Tiêu chuẩn đường cong đã được xây dựng cho KBVvà ong IPC do âm mưu Nhật ký của mỗi tiêu chuẩncâu thơ pha loãng giá trị TaqMan Ct (ngưỡng chu kỳlúc đó các sản phẩm đầu tiên của Đảng Cộng sản Romania đã được phát hiện).

Kết quả (Việt) 2:

Tây Ban Nha (Allen và Ball, 1995), Đức (Siede
và Buchler, 2003), Pháp (Gauthier et al.,
2003), Ấn Độ (Allen và Ball, 1996), Fiji (Allen
và Ball, 1996), Australia và New Zealand
(Hornitzky, 1981; Anderson, 1983; Hornitzky,
1987; Anderson, 1988; Todd và Ball, 2003).
nguồn riêng biệt của KBV đã được phân lập
ở các bộ phận khác nhau của thế giới, phân biệt
với nhau bằng cách so sánh của áo
protein (Allen và Ball, 1995).
Mục đích của việc này là để thực hiện một cuộc khảo sát
của tổ ong ở Anh và xứ Wales để xác định
tình trạng của KBV. Real-time PCR mồi
và một đầu dò được thiết kế để phát hiện cụ thể
của KBV và để khuếch đại các 18S rRNA
gene từ các máy chủ mật ong để sử dụng như một bộ
điều khiển tích cực. An khai thác tự động
phương pháp, dựa trên việc sử dụng silica bọc
hạt thuận đã được phát triển để cung cấp
sàng lọc nhanh hơn số lượng lớn các loài ong.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Mẫu virus
tinh khiết KBV phân lập được lấy từ khác nhau
địa điểm và các loài côn trùng. Cô lập KBV 14
(từ ong mật tại Úc, chính xác địa điểm không rõ)
16 (từ ong bumble ở Auckland, New
Zealand) và KBV NZ (từ mật ong ong ở Auckland,
New Zealand). Các chế phẩm khác tinh khiết vi rút
và ong bị nhiễm virus và nhộng đã được cung cấp
bởi nghiên cứu Rothamsted (Anh), USDA (Mỹ)
và HDLGN (Đức). Mẫu ong nhiễm
được vận chuyển ở nhiệt độ môi trường xung quanh trong 70%
ethanol, và bảo quản ở -20 C trước khi phân tích.
2.2. Real-time PCR mồi
và TaqMan? thăm dò thiết kế
dữ liệu trình tự gen cho protein áo từ
KBV và tình trạng tê liệt cấp tính liên quan chặt chẽ
virus (ABPV) đã được tải về từ các EMBL
cơ sở dữ liệu để so sánh trình tự của virus liên và nội
biến. Nhiều sự sắp xếp trình tự
đã được thực hiện bằng cách sử dụng thuật toán CLUSTAL V
trong gói MegAlign (DNASTAR inc.,
Madison, Mỹ). Mồi PCR thời gian thực và một
đầu dò được thiết kế (phần mềm Primer ExpressTM,
Applied Biosystems, Branchburg, USA) đến một khu vực
của chuỗi (sử dụng nhập AF263725) được bảo tồn
trong KBV nhưng khác biệt từ ABPV. Xét nghiệm này
đã được thử nghiệm cho phản ứng chéo với ABPV và
virus ong khác vi rút di động Đen hoàng hậu (BQCV),
vi rút Sacbrood (NHNN), virus cánh mây (CWV),
vi rút chậm tê liệt (SPV), virus cánh Deformed
(DWV), Virus mãn tính tê liệt (ĐCSVN) và Apis óng ánh
virus (AIV).
mồi PCR thời gian thực và một đầu dò được thiết kế
để các rRNA gene của Apis mellifera ong 18S
(AJ307465) để phục vụ như là một chứng dương nội
(IPC) để đánh giá axit nucleic khai thác effi-
tính hiệu. 5 'thuốc nhuộm phóng thiết bị đầu cuối cho các đầu dò
là 6-carboxyflurorescin (FAM) và JOETM và
3' là thức uống tetra-methylcarboxyrhodamine
(Tamra) (Tab. I).
2.3. Khảo sát của các thuộc địa cho KBV
ở Anh và xứ Wales
ong mật dành cho người lớn được thu thập từ các thuộc địa
trên khắp nước Anh và xứ Wales; mẫu được thu thập
bằng cách bổ nhiệm Thanh tra viên Bee và cá nhân
phát hiện đầu tiên của virus ong Kashmir ở Anh 183
người nuôi ong. Các mẫu được lấy từ cả hai khỏe mạnh
phát ban và không lành mạnh. Tất cả các mẫu ong được đặt
trực tiếp trong 40 mL polypropylene chai phổ quát
chứa 25 ml ethanol 70% và bảo quản ở 4 oC
trước khi dự thi.
2.4. Mô đồng nhất
Các mẫu khảo sát không được kiểm tra riêng
trong khi các mẫu khảo sát đã được thử nghiệm bởi bulking
5 ong với nhau cho mỗi mẫu, như vậy mà lớn hơn
số ong có thể được kiểm tra từ mỗi tổ ong.
Mẫu Non-khảo sát: con ong / ong được
đặt bên trong 2 mL vít nắp vi máy ly tâm
ống với hạt 3 tungsten carbide (3 mm) (Qiagen
Ltd, Crawley, Vương quốc Anh) và 1 ml dung dịch đệm ly giải (ThermoLabsystems,
Vantaa, Phần Lan); các ống được
gắn vào một máy trộn (Qiagen) và rung động
ở một biên độ 30 / s trong 3 phút. Các ống
được ly tâm ở 6000 g (nhiệt độ phòng) cho
3 phút để loại bỏ mảnh vụn. Mẫu điều tra ở Anh: cho
các mẫu khảo sát, hai lần nhắc lại mỗi có chứa
5 con ong, được xử lý mỗi mẫu khảo sát. Thừa
ethanol đã được gỡ bỏ khỏi tất cả các loài ong bởi thấm
vào khăn giấy. Mỗi lần lặp lại 5 con ong đã được
đặt trong một túi mài 100 mm × 150 mm lọc
(Bioreba, Reinach, Đức) với 5 ml dung giải
đệm (Thermo Labsystems) và mặt đất bằng tay
với một máy xay Homex (Bioreba). Lysate chiết
vào một mL ống nắp vặn 5. Ống được quay
tại 6000 g trong 1 phút để ăn viên mảnh vỡ.
2.5. Chiết RNA từ Ong
RNA được chiết xuất từ các lysate xóa
bằng cách sử dụng một số kit chiết RNA silica
(Thermo Labsystems) kết hợp với một từ
bộ vi xử lý hạt (Kingfisher ML, Thermo
Labsystems). Chương trình của nhà sản xuất 'Total_RNA_ML_1'
đã được sử dụng. Một thời gian ngắn, Kingfisher
ống đã được chuẩn bị như sau - ống 1: 1000 ml
của lysate xóa và 50 ml của hạt MagnaSil
(Promega); ống 2: 600 ml dung giải đệm b
(Promega); ống 3 và 4: 1 ml ethanol 70%;
ống 5: 200 ml nước vô trùng lớp phân tử
(BDH, Lutterworth, Vương quốc Anh). Các RNA kết quả tách rửa
vào ống 5 đã được chuyển giao cho một tươi 1,5 mL ống
và bảo quản ở -20 C trước khi sử dụng.
2.6. Real-time PCR xét nghiệm
tất cả các xét nghiệm đã được chạy như xét nghiệm simplex. Phản ứng
đã được thiết lập trong hoặc 96 hoặc 384 phản ứng cũng
tấm bằng PCR kits lõi thuốc thử (Applied Biosystems),
sau các giao thức cung cấp, nhưng với sự
bổ sung của 0,5 đơn vị của M-MLV sao chép ngược
(Promega) mỗi phản ứng. Đối với mỗi phản ứng, 1 ml
tổng RNA đã được thêm vào, cho một khối lượng cuối cùng của
25 ml. Các đĩa được rồi đạp xe tại hệ thống chung
điều kiện (48 C / 30 phút, 95 C / 10 phút và 40 chu kỳ
của 60 C / 1 phút, 95 C / 15 s) trong HT 7900
Hệ thống phát hiện Sequence (Applied Biosystems ),
sử dụng thu thập dữ liệu thời gian thực.
2.7. PCR Cloning và trình tự
các sản phẩm
sản phẩm Real-time PCR đã được trực tiếp ligated
vào plasmid pGEM? -T Easy Vector (Promega),
và chuyển đổi thành E. coli JM109 cao Effi-
tế bào ciency có thẩm quyền (Promega) theo
giao thức của nhà sản xuất. Khuẩn lạc màu trắng
có chứa plasmid với chèn đã được lựa chọn và
plasmid DNA đã tinh khiết sử dụng Plus Wizard?
SV hệ thống lọc miniprep DNA (Promega).
Nồng độ plasmid tinh khiết được điều chỉnh
20 ng ml-1 cho giải trình tự. Trình tự đã được thực
hiện bởi các dịch vụ DNAseq trình tự, Đại học
Dundee, Scotland.
2.8. Định lượng vi rút KBV tải trong
ong
Các KBV và ong IPC thời gian thực nghiệm PCR
được sử dụng để xác định số lượng vi rút KBV tải trong dương
mẫu Anh bằng cách sử dụng một đường cong chuẩn tương đối
phương (User Bulletin 2, Applied Biosystems). Đối với
phương pháp này, pha loãng tiêu chuẩn đã được chuẩn bị từ
RNA được chiết xuất từ một sự chuẩn bị KBV tinh khiết
(KBV 14) và từ ong thu thập được từ các CSL
nuôi ong. Mỗi tiêu chuẩn được pha loãng thông qua năm cấp độ
của một loạt pha loãng hai lần. Các pha loãng tiêu chuẩn
đã được thử nghiệm cùng với Anh KBV dương
mẫu RNA, và để so sánh, cùng với RNA
chiết xuất từ ong Úc biết đến là tự nhiên
bị nhiễm với mức độ cao của KBV hoặc ngấm ngầm
nhiễm (Dennis Anderson thông tin cá nhân).
Đường cong chuẩn đã được xây dựng cho KBV
và ong IPC bằng cách vẽ các bản ghi của mỗi tiêu chuẩn
pha loãng câu các TaqMan? Giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng
mà tại đó các sản phẩm PCR lần đầu tiên được phát hiện).