Expression and purification of reco

Expression and purification of recombinant proteins 100 μL frozen glycerol stock with the recombinant strain was inoculated into 50 mL of LB media containing 35 μg mL-1 kanamycin and 50 μg mL-1 chloramphenicol in a 250 mL flask on an incubator shaker (200 rpm) at 37oC. The 100 mM IPTG (Sigma, USA) stock was filtersterilized using a 0.22 lm filter and stored at -20 C. IPTG was then added to the cultures at a final concentration of 1 mM when the optical density of the cultures reached 0.3 at 600 nm (OD600) [7]. The cells were harvested after 6 h of cultivation by centrifugation at 6,000g at 4 C for 10 min to pellet the cells. The media was removed, and the cells were resuspended in PBS buffer (10 mM Na2HPO4,
1.8 mM KH2PO4, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 8.0) at a ratio of 5 mL buffer for each gram of cell wet weight. Lysozyme (Sigma, USA) was added to a final concentration of 5 mg mL-1, and the cell suspension was incubated on ice for 2 h. Triton X-100 was added to a concentration of 1 % (v/v), and the tube vigorously agitated. DNase and RNase (TransGen, China) were added to a final concentration of 5 μg mL-1, and the cells were incubated with rocking for an additional 10 min at 4 C. The insoluble debris was removed by centrifugation at 5,000g, 4 C for 10 min. The supernatant was collected and placed in an 80 C water bath for 25 min, cooled on ice for 20 min, and then centrifuged at 10,000g, 4 C for 20 min. The supernatant was loaded onto a Ni2+-NTA agarose column (NERCB, China) that was pre-equilibrated with 5x column volumes phosphate buffer (20 mM, pH 8.0) plus 50 mM NaCl. The column was eluted with a 20–500 mM imidazole gradient in 20 mM phosphate buffer (pH 8.0) plus 50 mM NaCl. The flow-through fraction was pooled and dialyzed against 20 mM phosphate buffer (pH 8.0) at room temperature overnight and finally concentrated using a Centrifugal Filter Unit (Millipore, USA). The SDS-PAGE gel electrophoresis was performed using a 5 % stacking gel and a 15 % separating gel (Bio-Rad Laboratories, USA).
Induction strategy
The defined medium (DM) for the shake flask cultures was composed of (g L-1) 10 glycerol, 15 K2HPO4, 7.5 KH2-PO4, 2.5(NH4)2SO4, 2 MgSO47H2O, 2 citric acid, and 1 mL of a trace elements solution. The trace elements solution contained (g L-1): 1.5 CaCl22H2O, 3.0 ZnSO4-7H2O, 2.8 CoSO47H2O, 0.2 CuCl22H2O, 2.0 MnCl2-4H2O, and 2.8 FeSO47H2O. The DM was supplemented with 35 μg mL-1 kanamycin and 50 μg mL-1 chloramphenicol.

Kết quả (Việt) 1:

Biểu hiện và thanh lọc của protein tái tổ hợp 100 μL đông lạnh glyxêrin cổ với tái tổ hợp chủng được tiêm chủng vào 50 mL LB phương tiện chứa 35 μg mL-1 kanamycin và 50 μg mL-1 chloramphenicol trong một flask 250 mL trên một shaker vườn ươm (200 rpm) tại 37oC. IPTG (Sigma, Hoa Kỳ) 100 mM báng là filtersterilized bằng cách sử dụng một bộ lọc lm 0,22 và được lưu trữ tại - 20 C. IPTG sau đó đã được thêm vào các nền văn hóa tại nồng độ cuối cùng của 1 mM khi mật độ quang học của các nền văn hóa đến 0,3 tại 600 nm (OD600) [7]. Các tế bào đã được thu hoạch sau 6 h trồng bởi số 6.000 g tại 4 C cho 10 phút để pellet các tế bào. Phương tiện truyền thông đã được gỡ bỏ, và các tế bào đã được resuspended trong bộ đệm PBS (10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 8.0) at a ratio of 5 mL buffer for each gram of cell wet weight. Lysozyme (Sigma, USA) was added to a final concentration of 5 mg mL-1, and the cell suspension was incubated on ice for 2 h. Triton X-100 was added to a concentration of 1 % (v/v), and the tube vigorously agitated. DNase and RNase (TransGen, China) were added to a final concentration of 5 μg mL-1, and the cells were incubated with rocking for an additional 10 min at 4 C. The insoluble debris was removed by centrifugation at 5,000g, 4 C for 10 min. The supernatant was collected and placed in an 80 C water bath for 25 min, cooled on ice for 20 min, and then centrifuged at 10,000g, 4 C for 20 min. The supernatant was loaded onto a Ni2+-NTA agarose column (NERCB, China) that was pre-equilibrated with 5x column volumes phosphate buffer (20 mM, pH 8.0) plus 50 mM NaCl. The column was eluted with a 20–500 mM imidazole gradient in 20 mM phosphate buffer (pH 8.0) plus 50 mM NaCl. The flow-through fraction was pooled and dialyzed against 20 mM phosphate buffer (pH 8.0) at room temperature overnight and finally concentrated using a Centrifugal Filter Unit (Millipore, USA). The SDS-PAGE gel electrophoresis was performed using a 5 % stacking gel and a 15 % separating gel (Bio-Rad Laboratories, USA).Induction strategyPhương tiện được xác định (DM) cho các nền văn hóa bình lắc là bao gồm (g L-1) 10 glyxêrin, 15 K2HPO4, 7.5 KH2-PO4, 2.5 (NH4) 2SO4, 2 MgSO47H2O, 2 axít citric, và 1 mL của một giải pháp nguyên tố. Các nguyên tố giải pháp chứa (g L-1): 1.5 CaCl22H2O, 3.0 ZnSO4-7H2O, 2.8 CoSO47H2O, cách 0.2 CuCl22H2O, 2.0 MnCl2-4H2O, và 2.8 FeSO47H2O. DM được bổ sung 35 μg mL-1 kanamycin và 50 μg mL-1 chloramphenicol.

Kết quả (Việt) 2:

Biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp 100 ml đông lạnh cổ glycerol với các chủng tái tổ hợp được cấy vào 50 ml LB phương tiện truyền thông có chứa 35 mg mL-1 kanamycin và 50 mg mL-1 chloramphenicol trong một ml bình 250 trên một shaker lồng ấp (200 rpm) ở 37oC. 100 mM IPTG (Sigma, Mỹ) chứng khoán được filtersterilized sử dụng một bộ lọc 0,22 lm và bảo quản ở -20 C. IPTG sau đó được bổ sung vào các nền văn hóa ở nồng độ cuối cùng của 1 mM khi mật độ quang học của các nền văn hóa đạt 0,3 ở 600 nm (OD600) [7]. Các tế bào được thu hoạch sau 6 h trồng trọt bằng cách ly tâm 6,000g ở 4 C trong 10 phút để thức ăn viên của các tế bào. Các phương tiện truyền thông đã được gỡ bỏ, và các tế bào được lơ lửng trong PBS đệm (10 mM Na2HPO4,
1,8 mM KH2PO4, 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 8,0) theo tỷ lệ 5 mL đệm cho mỗi gram của tế bào khối lượng ướt. Lysozyme (Sigma, USA) đã được thêm vào nồng độ cuối cùng của 5 mg mL-1, và treo tế bào được ủ trên băng cho 2 h. Triton X-100 đã được thêm vào với nồng độ 1% (v / v), và ống mạnh mẽ kích động. DNase và RNase (TransGen, Trung Quốc) đã được thêm vào nồng độ cuối cùng của 5 mg mL-1, và các tế bào được ủ với xích đu cho thêm 10 phút ở 4 C. Các mảnh vỡ không hòa tan được loại bỏ bằng cách ly tâm 5,000g, 4 C trong 10 phút. Nổi trên mặt đã được thu thập và được đặt trong một bồn tắm nước 80 C trong 25 phút, làm mát bằng nước đá trong 20 phút, và sau đó ly tâm ở 10,000g, 4 C trong 20 phút. Nổi trên mặt đã được nạp vào một Ni2 + -NTA cột agarose (NERCB, Trung Quốc) đã được tiền cân bằng với khối lượng cột 5x đệm phosphate (20 mM, pH 8,0) cộng với 50 mM NaCl. Các cột được tách rửa với một 20-500 mM imidazole gradient trong 20 mM đệm phosphate (pH 8,0) cộng với 50 mM NaCl. Các phần dòng chảy qua được gộp lại và thẩm tách với 20 mM đệm phosphate (pH 8.0) ở nhiệt độ phòng qua đêm và cuối cùng tập trung sử dụng một bộ lọc ly tâm Unit (Millipore, USA). Các SDS-PAGE gel điện di được thực hiện bằng cách sử dụng gel stacking 5% và 15% tách gel (Bio-Rad Laboratories, USA).
Chiến lược cảm ứng
Các phương tiện được xác định (DM) cho các nền văn hóa bình lắc đã bao gồm (g L-1 ) 10 glycerol, 15 K2HPO4, 7,5 KH2-PO4, 2.5 (NH4) 2SO4, 2 MgSO47H2O, 2 axit citric, và 1 ml dung dịch nguyên tố vi lượng. Các giải pháp nguyên tố vi lượng chứa (g L-1): 1,5 CaCl22H2O, 3.0 ZnSO4-7H2O, 2.8 CoSO47H2O, 0,2 CuCl22H2O, 2.0 MnCl2-4H2O, và 2,8 FeSO47H2O. DM đã được bổ sung 35 mg mL-1 kanamycin và 50 mg mL-1 chloramphenicol.