tryptophan) are fluorescent; hence,

tryptophan) are fluorescent; hence, proteins containing these amino acids have
intrinsic fluorescence. The purine and pyrimidine bases in nucleic acids (adenine, guanine, cytosine, uracil, thymine) and some coenzymes are
also intrinsic fluors. Intrinsic fluorescence is most often used to study protein
conformational changes (protein folding) and to probe the location of active sites
and coenzymes in enzymes.
Valuable information can also be obtained by the use of extrinsic fluors.
These are fluorescent molecules that are added to the biochemical system
under study. Many fluorescent dyes have enhanced fluorescence when they
are in a nonpolar solution or bound in a rigid hydrophobic environment.
Some of these dyes bind to specific sites on proteins or nucleic acid molecules,
and the resulting fluorescence intensity depends on the environmental conditions at the binding site. Extrinsic fluorescence is of value in characterizing the
binding of natural ligands to biochemically significant macromolecules. This
is because many of the extrinsic fluors bind in the same sites as natural ligands. Extrinsic fluorescence has been used to study the binding of fatty acids
to serum albumin, to characterize the binding sites for cofactors and substrates in enzyme molecules, to characterize the heme binding site in various
hemoproteins, and to study the intercalation of small molecules into the DNA
double helix.
Figure 7.14 shows the structures of extrinsic fluors that have been of value
in studying biochemical systems. ANS, dansyl chloride, and fluorescein are used
for protein studies, whereas ethidium, proflavine, and various acridines are useful for nucleic acid characterization. Ethidium bromide has the unique characteristic of enhanced fluorescence when bound to double-stranded DNA but not to
single-stranded DNA. Aminomethyl coumarin (AMC) is of value as a fluorogenic leaving group in measuring peptidase activity.
Difficulties in Fluorescence Measurements
Fluorescence measurements have much greater sensitivity than absorption
measurements. Therefore, the experimenter must take special precautions in
making fluorescence measurements because any contaminant or impurity in the
system can lead to inaccurate results. The following factors must be considered
when preparing for a fluorescence experiment.
Preparation of Reagents and Solutions
Since fluorescence measurements are very sensitive, dilute solutions of biomolecules and other reagents are appropriate. Special precautions must be taken to
maintain the integrity of these solutions. All solvents and reagents must be
checked for the presence of fluorescent impurities, which can lead to large errors
in measurement. “Blank” readings should be taken on all solvents and solutions,
and any background fluorescence must be subtracted from the fluorescence of
the complete system under study. Solutions should be stored in the dark, in clean
glass-stoppered containers, in order to avoid photochemical breakdown of the
reagents and contamination by corks and rubber stoppers. Some biomolecules,
especially proteins, tend to adsorb to glass surfaces, which can lead to loss of
1NAD+
, FAD2
Chapter 7 • Spectroscopic Analysis of Biomolecules 225
fluorescent material or to contamination of fluorescence cuvettes. All glassware
must be scrupulously cleaned. Turbid solutions must be clarified by centrifugation or filtration.
Control of Temperature
Fluorescence measurements, unlike absorption, are temperature dependent. All
solutions, especially if relative fluorescent measurements are taken, must be
thermostated at the same temperature.
C. NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE SPECTROSCOPY
Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a method of absorption
spectroscopy that has some characteristics similar to ultraviolet and visible spectroscopy, but also some that are unique. In NMR, a molecular sample, usually
dissolved in a liquid solvent, is placed in a magnetic field and the absorption of
radio-frequency waves by certain nuclei (protons and others) is measured.NMR

Kết quả (Việt) 2:

tryptophan) là huỳnh quang; do đó, các protein có chứa các acid amin có
huỳnh quang bên trong. Các purine và pyrimidine căn cứ ở axit nucleic (adenine, guanine, cytosine, uracil, thymine) và một số coenzyme là
cũng fluors nội tại. Huỳnh quang bên trong thường được sử dụng để nghiên cứu protein
thay đổi cấu (gấp protein) và để thăm dò vị trí của các trang web đang hoạt động
và coenzyme trong các enzym.
Thông tin có giá trị cũng có thể thu được bằng cách sử dụng các fluors bên ngoài.
Đây là những phân tử huỳnh quang có thể được thêm vào Hệ thống sinh hóa
được nghiên cứu. Nhiều thuốc nhuộm huỳnh quang đã tăng cường phát huỳnh quang khi họ
đang ở trong một giải pháp không phân cực hoặc liên kết trong một môi trường kị cứng nhắc.
Một số các thuốc nhuộm liên kết đến các trang web cụ thể trên các protein hay các phân tử axit nucleic,
và cường độ huỳnh quang kết quả phụ thuộc vào các điều kiện môi trường tại các trang web liên kết . Huỳnh quang bên ngoài có giá trị trong việc mô tả các
ràng buộc của các phối tử tự nhiên để các đại phân tử sinh hóa đáng kể. Điều này
là bởi vì nhiều người trong số các fluors bên ngoài ràng buộc trong các trang web tương tự như phối tử tự nhiên. Huỳnh quang bên ngoài đã được sử dụng để nghiên cứu sự liên kết của các axit béo
với albumin huyết thanh, để mô tả các trang web liên kết với đồng yếu tố và các chất nền trong phân tử enzyme, để đặc trưng cho các heme ràng buộc trang web trong nhiều
hemoproteins, và để nghiên cứu tính chất đan xen của các phân tử nhỏ vào DNA
xoắn kép.
Hình 7.14 mô tả các cấu trúc của fluors bên ngoài mà đã được các giá trị
trong việc nghiên cứu các hệ thống sinh hóa. ANS, dansyl chloride, và fluorescein được sử dụng
cho các nghiên cứu protein, trong khi ethidium, proflavine, và acridines khác nhau rất hữu ích cho nucleic axit đặc. Ethidium bromide có đặc tính độc đáo của việc tăng cường phát huỳnh quang khi bị ràng buộc vào DNA sợi kép nhưng không để
DNA sợi đơn. Aminomethyl coumarin (AMC) có giá trị như một nhóm ra fluorogenic trong đo lường hoạt động peptidase.
Những khó khăn trong huỳnh quang đo
đo huỳnh quang có độ nhạy cao hơn nhiều so với sự hấp thụ
đo. Vì vậy, người thí nghiệm phải có biện pháp phòng ngừa đặc biệt trong
làm các phép đo huỳnh quang bởi vì bất kỳ chất gây ô nhiễm hoặc tạp chất trong
hệ thống có thể dẫn đến kết quả không chính xác. Các yếu tố sau đây phải được xem xét
khi chuẩn bị cho một thí nghiệm huỳnh quang.
Chuẩn bị hoá chất và giải pháp
từ các phép đo huỳnh quang rất nhạy cảm, loãng giải pháp phân tử sinh học và thuốc thử khác là thích hợp. Biện pháp phòng ngừa đặc biệt phải được thực hiện để
duy trì tính toàn vẹn của các giải pháp này. Tất cả các dung môi và thuốc thử phải được
kiểm tra sự hiện diện của các tạp chất huỳnh quang, có thể dẫn đến sai sót lớn
trong đo lường. "Blank" đọc cần được thực hiện trên tất cả các dung môi và các giải pháp,
và bất kỳ nền huỳnh quang phải được trừ từ huỳnh quang của
các hệ thống hoàn chỉnh được nghiên cứu. Các giải pháp cần được lưu giữ trong bóng tối, trong sạch
lọ thủy tinh có nút đậy, để tránh sự cố quang hóa của các
chất phản ứng và nhiễm bẩn bởi nút chai và nắp cao su. Một số phân tử sinh học,
đặc biệt là protein, có xu hướng hấp thụ vào bề mặt kính, có thể dẫn đến mất
1NAD
+, FAD2
Chương 7 • Phân tích quang phổ phân tử sinh học 225
tài liệu huỳnh quang hay ô nhiễm của cuvette huỳnh quang. Tất cả thủy tinh
phải được triệt sạch. Giải pháp đục phải được làm rõ bằng cách ly tâm hoặc lọc.
Kiểm soát nhiệt độ
đo huỳnh quang, không giống như hấp thụ, là nhiệt độ phụ thuộc. Tất cả
các giải pháp, đặc biệt là nếu các phép đo huỳnh quang tương đối được thực hiện, phải được
thermostated ở cùng nhiệt độ.
C. HẠT NHÂN Magnetic Resonance Spectroscopy
hạt nhân cộng hưởng từ (NMR) là một phương pháp quang phổ hấp thụ
quang phổ mà có một số đặc điểm tương tự với tia cực tím và quang phổ nhìn thấy được, nhưng cũng có một số đó là duy nhất. Trong NMR, một mẫu phân tử, thường
tan trong dung môi lỏng, được đặt trong một từ trường và sự hấp thu
sóng vô tuyến tần số của hạt nhân nhất định (proton và những người khác) là measured.NMR