Virulence genes and serogrouping.A

Virulence genes and serogrouping.
A multiplex PCR to detect genes for F18 (F107), F41, F4 (K88), F5 (K99), and F6 (987P) fimbriae; heat-stable enterotoxins a and b (STa, STb), heat-labile enterotoxin, and Stx2 was performed on all of the isolates (4). The Stx2 primers also detected the edema disease variant, Stx2e. Strains were serogrouped using standard methods to determine if they belonged to serogroups commonly associated with edema disease (O138, O139, and O141) or to serogroup O147 (3). Typing for the H antigen was performed on representative strains by the E. coli Reference Center at Penn State University.

PFGE.
All of the serogroup O147 isolates recovered from outbreaks of edema disease between 1996 and 2001 (strain set 1) were analyzed by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) using standard methods (14). Briefly, the strains were grown overnight in tryptic soy broth, washed, and embedded in agarose plugs. The plugs were treated with lysozyme (1 mg/ml) in a lysis buffer with 10 mM Tris (pH 7.5), 50 mM NaCl, 100 mM EDTA (pH 8.0), 0.2% sodium deoxycholate, and 0.5% (wt/vol) N-lauroylsarcosine for 2 h at 37°C and then with proteinase K (0.5 mg/ml) in a buffer with 0.5 mM EDTA (pH 8.0) and 1% (wt/vol) N-lauroylsarcosine overnight at 55°C. The plugs were washed with 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and 10 mM Tris-1 mM EDTA buffer (pH 8.0) and then digested with 5 U of XbaI restriction enzyme overnight at 37°C. The DNA was separated using a 1% agarose gel on a CHEF-DR II system (Bio-Rad, Hercules, CA) with the following settings: initial switch time, 2.16 s; final switch time, 54.17 s; run time, 22 h at 150 V.
Multilocus restriction typing.
All of the E. coli O147 strains (strain set 1 plus the additional strains isolated prior to 1996) were analyzed using multilocus restriction typing (MLRT) (5). The seven housekeeping genes were selected for analysis based on previous work by Reid et al. (13). Primers were designed using DNAMAN software (Lynnon Corp., Quebec, Canada) and were selected from the published sequence of the E. coli K12 (strain MG1655) genome (Table ​(Table1).1). DNA was isolated from each of the strains, and a 50-μl PCR was performed for each of the seven genes. The PCR mixture included bacterial DNA, 0.015 μM of each primer, 0.2 mM of deoxynucleoside triphosphates (Roche, Switzerland), 3 mM of MgCl, 1× Amplitaq Gold Buffer, and 2.5 U Amplitaq Gold DNA polymerase (Perkin-Elmer, Branchburg, N.J.). After initial incubation at 95°C for 10 min, 40 amplification cycles were run, each including denaturing at 94°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and extension at 72°C for 90 seconds. A final extension was done at 72°C for 10 min, and the samples were held at 4°C until they were analyzed. The gene products were resolved on a 2% agarose gel, and the DNA bands were visualized by staining the gel with ethidium bromide. Gene products (20 μl) were incubated with 5 U of either HpaII or HhaI restriction enzyme (Table ​(Table1)1) in the appropriate buffer at 37°C overnight, and the restriction fragments were separated on a 4% agarose gel. The decision to use a particular restriction enzyme for fragmenting a PCR product was based on the banding pattern predicted for that PCR product by the E. coli K12 sequence. E. coli MG1655 was used as a positive control, and E. coli O157:H7 strain 933 was included as an outlier.

Kết quả (Việt) 2:

. Gen độc lực và serogrouping
Một PCR multiplex để phát hiện gen cho F18 (F107), F41, F4 (K88), F5 (K99), và F6 (987P) fimbriae; nhiệt ổn định độc tố a và b (STA, STB), enterotoxin nhiệt không ổn định, và stx2 được thực hiện trên tất cả các chủng (4). Các mồi stx2 cũng phát hiện các biến thể bệnh phù nề, Stx2e. Chủng này được serogrouped sử dụng phương pháp tiêu chuẩn để xác định xem họ thuộc nhóm huyết thanh thường liên quan đến bệnh phù (O138, O139, O141 và) hoặc nhóm huyết thanh O147 (3). Typing cho các kháng nguyên H đã được thực hiện trên các chủng đại diện của Trung tâm tham khảo E. coli tại Đại học. Penn State

PFGE.
Tất cả các nhóm huyết thanh O147 phân lập được thu hồi từ sự bùng phát của bệnh phù nề giữa những năm 1996 và 2001 (chủng tập 1) được phân tích bởi pulsed- điện trường gel (PFGE) sử dụng phương pháp tiêu chuẩn (14). Tóm lại, các chủng được trồng qua đêm trong canh đậu nành tryptic, rửa sạch, và nhúng vào trong phích cắm agarose. Các phích cắm đã được điều trị với lysozyme (1 mg / ml) trong một bộ đệm ly giải với 10 mM Tris (pH 7.5), 50 mM NaCl, 100 mM EDTA (pH 8,0), 0,2% natri deoxycholate, và 0,5% (wt / vol) N-lauroylsarcosine trong 2 giờ ở 37 ° C và sau đó với proteinase K (0,5 mg / ml) trong một bộ đệm với 0,5 mM EDTA (pH 8,0) và 1% (wt / vol) N-lauroylsarcosine qua đêm ở 55 ° C. Các phích cắm đã được rửa sạch với 1 mM phenylmethylsulfonyl florua và 10 mM Tris-1 mM EDTA đệm (pH 8,0) và sau đó tiêu hóa với 5 U của XbaI hạn chế enzyme qua đêm ở 37 ° C. DNA được tách ra bằng cách sử dụng agarose gel 1% trên một hệ thống CHEF-DR II (Bio-Rad, Hercules, CA) với các thiết lập sau đây: thời gian chuyển đổi ban đầu, 2,16 s; Hiện tắc cuối cùng, 54,17 s; chạy thời gian, 22 h ở 150 V.
Multilocus hạn chế đánh máy.
Tất cả các chủng O147 E.coli (chủng thiết lập 1 cộng với các chủng thêm bị cô lập trước năm 1996) được phân tích bằng multilocus gõ hạn chế (MLRT) (5). Bảy gen Dọn dẹp phòng hàng đã được lựa chọn để phân tích dựa trên công việc trước đây của Reid et al. (13). Mồi được thiết kế sử dụng phần mềm DNAMAN (Lynnon Corp, Quebec, Canada) và đã được lựa chọn từ các trình tự công bố của E. coli K12 (chủng MG1655) hệ gen (Table (Bảng 1) .1). DNA được phân lập từ mỗi chủng, và một PCR 50 ml đã được thực hiện cho mỗi một trong bảy gen. Các hỗn hợp PCR bao gồm DNA của vi khuẩn, 0.015 mM của mỗi lớp sơn lót, 0,2 mM triphosphate deoxynucleoside (Roche, Thụy Sĩ), 3 mM MgCl, 1 × Amplitaq Vàng đệm, và 2,5 U Amplitaq vàng DNA polymerase (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ ). Sau khi ủ ban đầu ở 95 ° C trong 10 phút, 40 chu kỳ khuếch đại đã được chạy, bao gồm biến tính ở 94 ° C trong 30 giây, ủ ở 55 ° C trong 30 giây, và mở rộng ở 72 ° C trong 90 giây. Một phần mở rộng cuối cùng đã được thực hiện ở 72 ° C trong 10 phút, và các mẫu được tổ chức tại 4 ° C cho đến khi họ được phân tích. Các sản phẩm gen đã được giải quyết trên gel agarose 2%, và các băng DNA được hình dung bằng cách nhuộm gel với ethidium bromide. Sản phẩm gen (20 ml) được ủ với 5 U của một trong hai HpaII hoặc HhaI hạn chế enzyme (Table (Bảng 1) 1) trong bộ đệm thích hợp ở 37 ° C qua đêm, và các mảnh vỡ hạn chế đã được tách trên gel agarose 4%. Quyết định sử dụng một enzyme giới hạn đặc biệt đối với phân mảnh một sản phẩm PCR được dựa trên mô hình dải dự đoán cho rằng sản phẩm PCR bằng chuỗi E. coli K12. E. coli MG1655 đã được sử dụng như một điều khiển tích cực, và E. coli O157: H7 căng 933 đã được đưa vào như một outlier.