The roles of lysine-54 (K54) and gl

The roles of lysine-54 (K54) and glutamate-192 (E192) of human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) in stabilizing the thiolate-FAD intermediate during electron transfer were investigated by site-directed mutagenesis. Recombinant human E3s, wild-type, K54E, S53K54-K53S54 (SK-KS), and E192Q, were overexpressed, purified, and characterized. Only K54E and SK-KS E3s had about 25% less bound FAD compared to wild-type, implicating that K54 is crucial for the protein-FAD interaction. The specific activities of all mutant E3s were markedly decreased (

Kết quả (Việt) 1:

Vai trò của lysine-54 (K54) và glutamate-192 (E192) của con người dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) trong ổn định trung bình thiolate-ham mê trong quá trình chuyển giao điện tử đã được điều tra do đạo diễn trang web mutagenesis. Tái tổ hợp của con người E3s, loại hoang, K54E, S53K54-K53S54 (SK-KS) và E192Q, đã được overexpressed, nước tinh khiết và đặc trưng. Chỉ có K54E và SK-KS E3s có khoảng 25% ít ràng buộc MỐT so với loại hoang, implicating K54 là rất quan trọng cho sự tương tác protein-MỐT. Các hoạt động cụ thể của tất cả đột biến E3s đã được giảm xuống rõ rệt (< loại hoang 5%). Trong trường hợp của K54E E3, Km cho lipoamide trong phản ứng ngược lại tăng khoảng gấp đôi. Đáng ngạc nhiên, SK-KS và E192Q E3s, Kms dihydrolipoamide (phản ứng chuyển tiếp) và lipoamide (phản ứng ngược) đã được đáng kể giảm. Xúc tác tỷ lệ hằng (kcat/Km) cho cả hai phản ứng cho SK-KS E3 thấp hơn đáng kể so với loại hoang, chỉ ra rằng K54 là rất quan trọng đối với hiệu quả tác dụng xúc tác của enzyme. Huỳnh quang phổ phân tích cho thấy các MỐT tại E3s đã được giảm bằng cách bổ sung dihydrolipoamide, và reoxidation của nó bởi NAD + trong đột biến E3s là chậm hơn so với loại hoang E3. Điều thú vị, K54E E3 dihydrolipoamide giảm MỐT một cách hiệu quả chỉ khi NAD + đã có mặt, chỉ ra rằng K54 ổn định tương tác thiolate-MỐT. Thiếu sự hình thành của Trung thiolate-ham mê trong sự vắng mặt của NAD + trong K54E E3 cũng được xác nhận bởi CD spectra. SK-KS đột biến chứng tỏ rằng trình tự chính xác của dư lượng là quan trọng như là bản chất của dư lượng axít amin. Những kết quả này gợi ý rằng K54 đóng một vai trò quan trọng trong ổn định trung bình thiolate-MỐT trong khi chuyển điện tử trong phản ứng, và E192 là tham gia vào việc duy trì đúng hướng của K54 trong quá trình xúc tác.

Kết quả (Việt) 2:

Vai trò của lysine-54 (K54) và glutamate-192 (E192) dehydrogenase dihydrolipoamide con người (E3) trong việc ổn định thiolate-FAD trung gian trong quá trình chuyển điện tử đã được nghiên cứu bởi đột biến trang web chỉ dẫn. E3s con người tái tổ hợp, hoang dại, K54E, S53K54-K53S54 (SK-KS), và E192Q, được biểu hiện quá mức, tinh khiết, và đặc trưng. Chỉ K54E và SK-KS E3s có khoảng 25% ít FAD ràng buộc so với hoang dại, liên lụy mà K54 là rất quan trọng cho sự tương tác protein-FAD. Các hoạt động cụ thể của tất cả các E3s đột biến đã giảm đáng kể (<5% hoang dại). Trong trường hợp của K54E E3, Km cho lipoamide trong phản ứng ngược được tăng lên khoảng gấp đôi. Đáng ngạc nhiên, cho cả SK-KS và E192Q E3s, các Kms cho cả dihydrolipoamide (phía trước phản ứng) và lipoamide (đảo ngược phản ứng) đã giảm rõ rệt. Các hằng số tốc độ xúc tác (kcat / Km) cho cả hai phản ứng cho SK-KS E3 thấp hơn so với hoang dại đáng kể, chỉ ra rằng K54 là rất quan trọng đối với hiệu quả xúc tác của enzym. Huỳnh quang phân tích quang phổ cho thấy FAD trong E3s được giảm bằng cách cho thêm dihydrolipoamide, và rằng reoxidation của nó bởi NAD + trong E3s đột biến là chậm hơn so với hoang dại E3. Điều thú vị là, trong K54E E3 dihydrolipoamide giảm FAD hiệu quả chỉ khi NAD + đã có mặt, chỉ ra rằng K54 ổn định sự tương tác thiolate-FAD. Việc thiếu sự hình thành của thiolate-FAD trung gian trong sự vắng mặt của NAD + trong K54E E3 cũng được xác nhận bởi CD phổ. SK-KS đột biến chứng minh rằng đúng trình tự của dư lượng là quan trọng như bản chất của các amino acid. Những kết quả này gợi ý rằng K54 đóng một vai trò quan trọng trong việc ổn định thiolate-FAD trung gian trong quá trình chuyển electron trong phản ứng, và E192 được tham gia trong việc duy trì định hướng chính xác của K54 trong xúc tác.