Sperm DNA fragmentation: paternal e

Sperm DNA fragmentation: paternal effect on early
post-implantation embryo development in ART
A.Borini1,4, N.Tarozzi1
, D.Bizzaro2
, M.A.Bonu1
, L.Fava1
, C.Flamigni3
and G.Coticchio1
1
Tecnobios Procreazione, Centre for Reproductive Health, Via Dante 15, Bologna, 2
Institute of Biology and Genetic,
University Polytechnic of Marche, Via Brecce Bianche, Ancona and 3
University of Bologna, Bologna, Italy
4
To whom correspondence should be addressed at: Tecnobios Procreazione, Centre for Reproductive Health, Via Dante 15,
I-40125 Bologna, Italy. E-mail: [e-mail]
BACKGROUND: The relationship between early embryo post-implantation development in couples undergoing assisted
reproductive techniques (ARTs) and sperm chromatin alterations has not been satisfactorily explained. The aim of this
study was to assess the relationship between sperm DNA fragmentation in IVF/ICSI patients, sperm parameters (concentration,
motility and morphology) and ART outcome, especially with regard to clinical pregnancy and pregnancy loss
(spontaneous miscarriage or biochemical pregnancy). METHODS: DNA fragmentation was evaluated by TUNEL assay,
performed on sperm suspensions after density gradient separation, in 132 men undergoing an ART cycle (82 IVF and 50
ICSI) and correlated with sperm parameters and ART outcome. RESULTS: A highly significant negative correlation was
found between DNA fragmentation and sperm parameters. There was a close relationship between DNA fragmentation
and post-implantation development in ICSI patients: the clinical pregnancy and pregnancy loss rates significantly
differed between patients with high and low sperm DNA fragmentation (P = 0.007 and P = 0.009, respectively).
CONCLUSIONS: Sperm DNA fragmentation seems to affect embryo post-implantation development in
ICSI procedures: high sperm DNA fragmentation can compromise ‘embryo viability’, resulting in pregnancy loss.
Key words: abortion/ART/DNA fragmentation/human sperm/pregnancy
Introduction
Many studies have shown how a ‘paternal effect’ can cause
repeated assisted reproductive technique (ART) failures
(Vanderzwalmen et al., 1991; Perinaud et al., 1993; Janny and
Menezo, 1994; Hammadeh et al., 1996; Sanchez et al., 1996;
Shoukir et al., 1998). Many authors have shown how this
‘paternal effect’ can be traced back to anomalies in sperm
chromatin organization: the sperm of subfertile men are characterized
by susceptibility to acid-induced denaturation in situ
(Spano et al., 2000), reduced chromatin condensation (Bianchi
et al., 1996), chromosomic anomalies (Moosani et al., 1995)
and/or increased DNA strand breaks (Lopes et al., 1998; Irvine
et al., 2000). It has been shown how a high percentage of spermatozoa
with alterations in chromatin structure has a negative
effect on ART procedure outcome (Sun et al., 1997; Lopes
et al., 1998; Larson et al., 2000; Morris et al., 2002; Benchaib
et al., 2003). These studies have focused on testing for possible
correlations between paternal chromatin alterations and fertilization,
embryo cleavage, blastocyst development and clinical
pregnancy rates, in both IVF and ICSI.
These findings suggest that paternal genomic alterations
may compromise not only fertilization and embryo quality but
also ‘embryo viability’ and progression of pregnancy, resulting
in spontaneous miscarriage or biochemical pregnancy. To date,
a number of studies in men and animals have highlighted the
importance of the ‘paternal factor’, including male age or paternal
exposure to toxic materials, in spontaneous miscarriages
(Olshan and Faustman, 1993; Marchetti et al., 1999; Carrell and
Liu, 2003; Carrell et al., 2003; Hjollund et al., 2005; Slama
et al., 2005), but the relationship between ‘early post-implantation
embryo development’ in couples undergoing ART and sperm
DNA integrity still remains to be explained. The effect of
altered sperm chromatin integrity on post-embryonic development
is therefore still a matter of debate (Larson et al., 2000).
The aim of this study was to examine, in IVF and ICSI
patients, the possible relationship between sperm DNA fragmentation,
assessed by TUNEL assay, traditional sperm evaluation
parameters (concentration, motility and morphology) and
ART outcome, especially in regard to clinical pregnancy and,
as a new issue, pregnancy loss, the latter defined as spontaneous
miscarriage or biochemical pregnancy.
Subjects and methods
Patients
The study was carried out at Tecnobios Procreazione, Bologna, Italy.
A total of 132 couples undergoing an ART cycle were included: 50
cycles were ICSI and 82 IVF. The mean age of women included in the
by guest on June 4, 2013 http://humrep.oxfordjournals.org/ Downloaded from
Sperm DNA fragmentation and the post-implantation embryo
2877
study was 37.05 ± 4.19 years and the mean BMI was 22.17 ± 3.13 kg/
m2
. The mean age of men was 40.24 ± 5.17 years. Only men with
ejaculated sperm were included in the study.
The indication for ICSI treatment was severe male factor (sperm
concentration

Kết quả (Việt) 1:

Sperm DNA fragmentation: paternal effect on earlypost-implantation embryo development in ARTA.Borini1,4, N.Tarozzi1, D.Bizzaro2, M.A.Bonu1, L.Fava1, C.Flamigni3 and G.Coticchio11Tecnobios Procreazione, Centre for Reproductive Health, Via Dante 15, Bologna, 2Institute of Biology and Genetic,University Polytechnic of Marche, Via Brecce Bianche, Ancona and 3University of Bologna, Bologna, Italy4To whom correspondence should be addressed at: Tecnobios Procreazione, Centre for Reproductive Health, Via Dante 15,I-40125 Bologna, Italy. E-mail: [e-mail]: The relationship between early embryo post-implantation development in couples undergoing assistedreproductive techniques (ARTs) and sperm chromatin alterations has not been satisfactorily explained. The aim of thisstudy was to assess the relationship between sperm DNA fragmentation in IVF/ICSI patients, sperm parameters (concentration,motility and morphology) and ART outcome, especially with regard to clinical pregnancy and pregnancy loss(spontaneous miscarriage or biochemical pregnancy). METHODS: DNA fragmentation was evaluated by TUNEL assay,performed on sperm suspensions after density gradient separation, in 132 men undergoing an ART cycle (82 IVF and 50ICSI) and correlated with sperm parameters and ART outcome. RESULTS: A highly significant negative correlation wasfound between DNA fragmentation and sperm parameters. There was a close relationship between DNA fragmentationand post-implantation development in ICSI patients: the clinical pregnancy and pregnancy loss rates significantly
differed between patients with high and low sperm DNA fragmentation (P = 0.007 and P = 0.009, respectively).
CONCLUSIONS: Sperm DNA fragmentation seems to affect embryo post-implantation development in
ICSI procedures: high sperm DNA fragmentation can compromise ‘embryo viability’, resulting in pregnancy loss.
Key words: abortion/ART/DNA fragmentation/human sperm/pregnancy
Introduction
Many studies have shown how a ‘paternal effect’ can cause
repeated assisted reproductive technique (ART) failures
(Vanderzwalmen et al., 1991; Perinaud et al., 1993; Janny and
Menezo, 1994; Hammadeh et al., 1996; Sanchez et al., 1996;
Shoukir et al., 1998). Many authors have shown how this
‘paternal effect’ can be traced back to anomalies in sperm
chromatin organization: the sperm of subfertile men are characterized
by susceptibility to acid-induced denaturation in situ
(Spano et al., 2000), reduced chromatin condensation (Bianchi
et al., 1996), chromosomic anomalies (Moosani et al., 1995)
and/or increased DNA strand breaks (Lopes et al., 1998; Irvine
et al., 2000). It has been shown how a high percentage of spermatozoa
with alterations in chromatin structure has a negative
effect on ART procedure outcome (Sun et al., 1997; Lopes
et al., 1998; Larson et al., 2000; Morris et al., 2002; Benchaib
et al., 2003). These studies have focused on testing for possible
correlations between paternal chromatin alterations and fertilization,
embryo cleavage, blastocyst development and clinical
pregnancy rates, in both IVF and ICSI.
These findings suggest that paternal genomic alterations
may compromise not only fertilization and embryo quality but
also ‘embryo viability’ and progression of pregnancy, resulting
in spontaneous miscarriage or biochemical pregnancy. To date,
a number of studies in men and animals have highlighted the
importance of the ‘paternal factor’, including male age or paternal
exposure to toxic materials, in spontaneous miscarriages
(Olshan and Faustman, 1993; Marchetti et al., 1999; Carrell and
Liu, 2003; Carrell et al., 2003; Hjollund et al., 2005; Slama
et al., 2005), but the relationship between ‘early post-implantation
embryo development’ in couples undergoing ART and sperm
DNA integrity still remains to be explained. The effect of
altered sperm chromatin integrity on post-embryonic development
is therefore still a matter of debate (Larson et al., 2000).
The aim of this study was to examine, in IVF and ICSI
patients, the possible relationship between sperm DNA fragmentation,
assessed by TUNEL assay, traditional sperm evaluation
parameters (concentration, motility and morphology) and
ART outcome, especially in regard to clinical pregnancy and,
as a new issue, pregnancy loss, the latter defined as spontaneous
miscarriage or biochemical pregnancy.
Subjects and methods
Patients
The study was carried out at Tecnobios Procreazione, Bologna, Italy.
A total of 132 couples undergoing an ART cycle were included: 50
cycles were ICSI and 82 IVF. The mean age of women included in the
by guest on June 4, 2013 http://humrep.oxfordjournals.org/ Downloaded from
Sperm DNA fragmentation and the post-implantation embryo
2877
study was 37.05 ± 4.19 years and the mean BMI was 22.17 ± 3.13 kg/
m2
. The mean age of men was 40.24 ± 5.17 years. Only men with
ejaculated sperm were included in the study.
The indication for ICSI treatment was severe male factor (sperm
concentration <10 × 106
/ml and/or sperm motility <30% and/or normal
sperm morphology <4%). This was associated with oligo-ovulation
in 1 couple (2%), endometriosis in 5 couples (10%) and tubal
defects in 10 couples (20%); aetiology of infertility was only male
factor in 27 couples (54%) and unexplained in 7 couples (14%). In
IVF patients, the aetiology of infertility was oligo-ovulation in 2 couples
(2.4%), endometriosis in 14 couples (17.1%), unexplained in 17
couples (20.7%), tubal defects in 39 couples (47.6%) and male factor
in 10 couples (12.2%).
Sperm collection and preparation
Sperm samples were collected by masturbation. Samples were analysed
following WHO indications (WHO, 1999) for total sperm
number, concentration, motility and morphology and were prepared
using a discontinuous PureSperm gradient (Nidacon, Gothemberg,
Sweden). Briefly, sperm was layered upon a 40:80% PureSperm density
gradient, processed by centrifuge at 600 × g for 15 min and resuspended
in 1 ml of sperm culture medium (PureSperm wash, Nidacon,
Gothemberg, Sweden). After density gradient separation, a second
evaluation of concentration, motility and morphology was performed.
Ovarian stimulation, IVF, ICSI and embryo development
Ovarian stimulation was achieved by recombinant FSH (Gonal F,
Serono, Rome, Italy; Puregon, Organon, Rome, Italy) and monitored
by endovaginal echography and plasma estradiol. Thirty-six hours
before oocyte retrieval, 10 000 IU of hCG (Gonasi, Amsa, Rome,
Italy) was administered. Oocyte retrieval was carried out under general
anaesthesia by a vaginal ultrasonography-guided aspiration. At
16–18 h after insemination or microinjection, as previously described
(Borini et al., 2004a,b), oocytes were assessed for two PN presence.
Forty-eight hours after oocyte retrieval, embryos were classified
according to morphology and then transferred into the uterus. Clinical
pregnancy was determined by ultrasound detection of gestational
sac and biochemical pregnancy by the presence of only one positive
β-hCG measurement.
DNA fragmentation analysis
Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate
(dUTP) in situ DNA nick end labelling (TUNEL) assay
was performed on sperm suspension after density gradient separation
as previously described by Benchaib et al. (2003). Briefly, part of the
sperm sample was used for oocyte insemination, whereas the other
part of semen suspension was washed in phosphate-buffered saline
(PBS) (Sigma-Aldrich, Milan, Italy), smeared onto microscope slides,
fixed in 4% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich) in PBS for 30 min at
4°C and permeabilized with 0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate
(Sigma-Aldrich). Strand breaks in DNA were detected by
TUNEL using a commercially available kit (In situ Cell Death Detection
Kit, Fluorescein, Roche, Monza, Italy) according to the manufacturer’s
instructions. A negative control was performed for each
sample by using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labelled dUTP
without enzyme. The percentage of spermatozoa with fragmented
DNA was determined by direct observation of 500 spermatozoa per
sample with an epifluorescence microscope (NIKON eclipse 80i,
Florence, Italy).
IVF patients were divided in two groups: group A (n = 69), low
TUNEL patients (TUNEL positivity <10%); group B (n = 13), high
TUNEL patients (TUNEL positivity ≥10%). ICSI patients were also
divided in two groups: group C (n = 20), low TUNEL patients
(TUNEL positivity <10%); group D (n = 30), high TUNEL patients
(TUNEL positivity ≥10%). The threshold value of 10% was chosen in
line with the previous study of Benchaib et al. (2003) performed using
the same technique for sperm preparation (density gradient separation
with PureSperm) and for detection of DNA damage on the sperm suspension
obtained in this manner (TUNEL assay and evaluation of positive
sperms with epifluorescence microscope).
Outcome definitions and statistical analysis
(i) Clinical pregnancy rate was defined as the number of patients
with fetal heartbeat divided by the number of treatments;
(ii) Biochemical pregnancy rate was the number of biochemical
pregnancies divided by the number of β-HCG positive patients;
(iii) Spontaneous miscarriage rate was the number of spontaneous
miscarriages divided by the number of β-HCG positive patients;
(iv) Pregnancy loss rate was the number of biochemical pregnancies
and spontaneous miscarriages divided by the number of β-HCG
positive patients;
(v) TUNEL positivity rate was the number of patients with DNA
fragmentation >10% divided by the number of treatments.
Statistical analysis was performed with SPSS for Windows software
package version 10.1 (SPSS, Chicago, IL, USA). The Kolmogorov–
Smirnov test was used to determine whether the data were random samples
from a normal distribution. The chi-square test or Fisher exact
test was used to compare clinical pregnancy rates, pregnancy loss
rates and number of previous ART treatments in different groups

Kết quả (Việt) 2:

Phân mảnh DNA tinh trùng: có tác dụng nội trên đầu
phát triển của phôi sau cấy trong ART
A.Borini1,4, N.Tarozzi1
, D.Bizzaro2
, MABonu1
, L.Fava1
, C.Flamigni3
và G.Coticchio1
1
Tecnobios Procreazione, Trung tâm Sức khỏe sinh sản , Via Dante 15, Bologna, 2
Viện Sinh học và Di truyền,
Trường Đại học Bách khoa Marche, Via Brecce Bianche, Ancona và 3
trường Đại học Bologna, Bologna, Italy
4
Để người thư nên được giải quyết ở: Tecnobios Procreazione, Trung tâm Sức khỏe sinh sản, Via Dante 15,
I-40.125 Bologna, Italy. E-mail: [e-mail]
BỐI CẢNH: Mối quan hệ giữa phôi ban đầu phát triển sau cấy trong các cặp vợ chồng trải qua sự trợ giúp của
kỹ thuật sinh sản (nghệ thuật) và các biến đổi nhiễm sắc thể của tinh trùng đã không được thỏa đáng giải thích. Mục đích của bài
nghiên cứu là đánh giá mối quan hệ giữa tinh trùng DNA phân mảnh ở những bệnh nhân IVF / ICSI, các thông số tinh trùng (nồng độ,
khả năng vận động và hình thái) và kết cục ART, đặc biệt là đối với các thai lâm sàng và sẩy thai với
(sẩy thai tự nhiên hay mang thai sinh hóa). Phương pháp: phân mảnh DNA được đánh giá bởi tunel khảo nghiệm,
thực hiện trên hệ thống treo tinh trùng sau khi mật độ dốc tách, trong 132 người đàn ông trải qua một chu kỳ ART (82 IVF và 50
ICSI) và tương quan với các thông số tinh trùng và kết quả điều trị ARV. KẾT QUẢ: Có sự tương quan tiêu cực rất quan trọng được
tìm thấy giữa các mảnh DNA và các thông số tinh trùng. Có một mối quan hệ chặt chẽ giữa phân mảnh DNA
và sự phát triển sau cấy ghép ở những bệnh nhân ICSI: tỷ lệ thai lâm sàng và sẩy thai đáng kể
khác nhau giữa các bệnh nhân với phân mảnh DNA tinh trùng cao và thấp (P = 0,007 và P = 0.009, tương ứng).
Kết luận: Tinh trùng phân mảnh DNA dường như ảnh hưởng đến phát triển của phôi sau cấy trong
thủ tục ICSI: tinh trùng cao DNA phân mảnh có thể thỏa hiệp 'phôi khả năng tồn tại ", dẫn đến sẩy thai.
Từ khóa: phá thai / ART / DNA phân mảnh / con người tinh trùng / thai
Giới thiệu
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra như thế nào một "hiệu ứng nội 'có thể gây ra
lặp đi lặp lại hỗ trợ kỹ thuật sinh sản (ART) thất bại
(Vanderzwalmen et al 1991,;. Perinaud et al, 1993;. Janny và
Menezo, 1994; Hammadeh et al 1996,;. Sanchez et al., 1996;
Shoukir et al., 1998). Nhiều tác giả đã chỉ ra cách này
'có hiệu lực nội' có thể được truy trở lại dị thường trong tinh trùng
tổ chức nhiễm sắc: tinh trùng của người đàn ông subfertile được đặc trưng
bởi tính nhạy cảm với sự biến tính axit gây ra tại chỗ
, ​​giảm sự ngưng tụ chất nhiễm sắc ((Spano et al., 2000) Bianchi
. et al, 1996), bất thường chromosomic (Moosani et al, 1995).
phá vỡ và / hoặc tăng strand DNA (Lopes et al, 1998;. Irvine
. et al, 2000). Nó đã được chứng minh làm thế nào một tỷ lệ phần trăm cao của tinh trùng
với sự thay đổi trong cấu trúc nhiễm sắc thể có tiêu cực
ảnh hưởng đến kết quả thủ tục ART (Sun et al 1997,;. Lopes
et al 1998,;. Larson et al, 2000;.. Morris et al, 2002; Benchaib
. et al, 2003). Những nghiên cứu đã tập trung vào thử nghiệm để có thể
tương quan giữa sự thay đổi nội chromatin và thụ tinh,
giai đoạn phân chia, phát triển phôi thai lâm sàng và
tỉ lệ có thai, trong cả hai IVF và ICSI.
Những phát hiện này cho thấy sự biến đổi gen của cha
có thể thỏa hiệp không chỉ thụ tinh và chất lượng phôi nhưng
cũng ' phôi khả năng tồn tại và tiến triển của thai kỳ, kết quả
trong tự nhiên mang thai bị sẩy thai hoặc sinh hóa. Đến nay,
một số nghiên cứu ở người và động vật đã nêu bật
tầm quan trọng của "yếu tố nội ', bao gồm tuổi nam hay cha
tiếp xúc với các chất độc hại, trong trường hợp sẩy thai tự phát
(Olshan và Faustman năm 1993; Marchetti et al, 1999;. Carrell và
Liu, 2003; Carrell et al, 2003;. Hjollund et al, 2005;. SLAMA
. et al, 2005), nhưng mối quan hệ giữa "hậu cấy đầu
phát triển của phôi 'trong các cặp vợ chồng trải qua ART và tinh trùng
vẹn DNA vẫn còn để được giải thích. Ảnh hưởng của
biến đổi nhiễm sắc vẹn tinh trùng phát triển hậu phôi
do đó vẫn là một vấn đề của cuộc tranh luận (Larson et al., 2000).
Mục đích của nghiên cứu này là để kiểm tra, trong IVF và ICSI
bệnh nhân, các mối quan hệ có thể có giữa các mảnh DNA tinh trùng ,
đánh giá của tunel khảo nghiệm, đánh giá truyền thống tinh trùng
thông số (nồng độ, sự vận động và hình thái) và
kết quả ART, đặc biệt là liên quan đến thai lâm sàng và,
như là một vấn đề mới, sẩy thai, sau này được xác định là tự phát
sẩy thai hoặc thai sinh hóa.
Đối tượng và phương pháp
Bệnh nhân
. Nghiên cứu được thực hiện tại Tecnobios Procreazione, Bologna, Italy
Tổng cộng có 132 cặp vợ chồng trải qua một chu kỳ ART đã được bao gồm: 50
chu kỳ là ICSI và 82 IVF. Tuổi trung bình của phụ nữ bao gồm trong
bởi khách vào ngày 04 Tháng Sáu 2013 http://humrep.oxfordjournals.org/ Tải về từ
tinh trùng phân mảnh DNA và sau cấy phôi
2877
nghiên cứu là 37,05 ± 4,19 năm và BMI trung bình là 22,17 ± 3.13 kg /
m2
. Tuổi trung bình của nam giới là 40,24 ± 5,17 năm. Chỉ có những người đàn ông có
tinh trùng xuất tinh được đưa vào nghiên cứu.
Các chỉ định điều trị ICSI là yếu tố đực nặng (tinh trùng
nồng độ <10 × 106
/ ml và / hoặc nhu động tinh trùng <30% và / hoặc bình thường
hình thái tinh trùng <4%). Điều này đã được liên kết với oligo-rụng trứng
trong 1 cặp (2%), lạc nội mạc tử trong 5 cặp vợ chồng (10%) và ống dẫn trứng
khuyết tật trong 10 cặp vợ chồng (20%); nguyên nhân của vô sinh là chỉ nam
yếu tố trong 27 cặp vợ chồng (54%) và giải thích được trong 7 cặp vợ chồng (14%). Trong
các bệnh nhân IVF, nguyên nhân của vô sinh là oligo-rụng trứng 2 cặp
(2,4%), lạc nội mạc tử trong 14 cặp vợ chồng (17,1%), không giải thích được trong 17
cặp vợ chồng (20,7%), khiếm khuyết ống dẫn trứng trong 39 cặp vợ chồng (47,6%) và yếu tố nam
trong 10 cặp vợ chồng (12,2%).
bộ sưu tập tinh trùng và chuẩn bị
tinh trùng mẫu được thu thập bằng cách thủ dâm. Các mẫu được phân tích
WHO chỉ (WHO, 1999) cho tổng số tinh trùng sau
số, tập trung, khả năng vận động và hình thái học và đã được chuẩn bị
bằng cách sử dụng một PureSperm dốc liên tục (Nidacon, Gothemberg,
Thụy Điển). Tóm lại, tinh trùng đã được xếp lớp trên một 40: 80% mật độ PureSperm
gradient, xử lý bằng máy ly tâm tại 600 × g trong 15 phút và lơ lửng
trong 1 ml môi trường nuôi cấy tinh trùng (rửa PureSperm, Nidacon,
Gothemberg, Thụy Điển). Sau khi mật độ tách gradient, một thứ hai
đánh giá tập trung, khả năng vận động và hình thái học đã được thực hiện.
kích thích buồng trứng, IVF, ICSI và phát triển của phôi
kích thích buồng trứng đã đạt được bằng cách tái tổ hợp FSH (Gonal F,
Serono, Rome, Italy; Puregon, Organon, Rome, Ý ) và được giám sát
bởi siêu âm endovaginal và estradiol trong huyết tương. Ba mươi sáu giờ
trước khi lấy tế bào trứng, 10 000 IU hCG (Gonasi, Amsa, Rome,
Italy) đã được quản lý. Hồi tế bào trứng được thực hiện dưới chung
gây mê bằng một siêu âm dẫn đường khát vọng âm đạo. Tại
16-18 giờ sau khi thụ tinh hoặc tiêm, như được mô tả trước đây
(Borini et al., 2004a, b), tế bào trứng đã được đánh giá đối với hai mặt PN.
Bốn mươi tám giờ sau khi lấy tế bào trứng, phôi được phân loại
theo hình thái và sau đó được chuyển thành tử cung. Lâm sàng
mang thai được xác định bằng siêu âm phát hiện của thai
sac thai và sinh hóa bởi sự hiện diện của chỉ một tích cực
đo β-hCG.
phân mảnh phân tích ADN
ga deoxynucleotidyl transferase qua trung gian deoxyuridine triphosphate
(dUTP) về nhãn cuối DNA nick situ (tunel) khảo nghiệm
đã được thực hiện đình chỉ tinh trùng sau khi mật độ dốc tách
mô tả như trước đây bởi Benchaib et al. (2003). Tóm lại, một phần của
mẫu tinh trùng đã được sử dụng cho các tế bào trứng thụ tinh, trong khi khác
là một phần của hệ thống treo tinh dịch đã được rửa sạch trong nước muối đệm phosphat
(PBS) (Sigma-Aldrich, Milan, Italy), bôi lên lam kính,
cố định trong 4% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich) trong PBS trong 30 phút ở
nhiệt độ 4 ° C và permeabilized với 0,1% Triton X-100 0.1% sodium citrate
(Sigma-Aldrich). Phá vỡ sợi trong DNA được phát hiện bằng
cách sử dụng một bộ tunel thương mại có sẵn (In situ di Chết Detection
Kit, fluorescein, Roche, Monza, Italy) theo của nhà sản xuất
hướng dẫn. Một kiểm soát tiêu cực đã được thực hiện cho từng
mẫu bằng cách sử dụng isothiocyanate fluorescein (FITC) -labelled dUTP
mà không enzyme. Tỷ lệ tinh trùng có bị phân mảnh
DNA đã được xác định bằng cách quan sát trực tiếp của 500 tinh trùng mỗi
mẫu bằng kính hiển vi epifluorescence (NIKON eclipse 80i,
Florence, Italy).
bệnh nhân IVF được chia thành hai nhóm: nhóm A (n = 69), thấp
bệnh nhân Tunel (tunel dương <10%); nhóm B (n = 13), cao
bệnh nhân tunel (tunel dương ≥10%). Bệnh nhân ICSI cũng được
chia thành hai nhóm: nhóm C (n = 20), bệnh nhân tunel thấp
(tunel dương <10%); nhóm D (n = 30), bệnh nhân tunel cao
(tunel dương ≥10%). Các giá trị ngưỡng 10% đã được lựa chọn
phù hợp với các nghiên cứu trước đây của Benchaib et al. (2003) thực hiện bằng cách sử dụng
các kỹ thuật tương tự để chuẩn bị tinh trùng (mật độ tách Gradient
với PureSperm) và để phát hiện các tổn thương DNA về việc đình chỉ tinh trùng
thu được theo cách này (tunel khảo nghiệm và đánh giá tích cực
với tinh trùng epifluorescence kính hiển vi).
định nghĩa Kết quả và phân tích thống kê
(i) tỷ lệ có thai lâm sàng được định nghĩa là số lượng bệnh nhân
có nhịp tim của thai nhi được chia cho số lần điều trị;
(ii) tỷ lệ mang thai Sinh hóa là số lượng sinh hóa
mang thai được chia cho số lượng bệnh nhân β-HCG dương tính;
(iii) tự phát tỷ lệ sẩy thai là số tự phát
sẩy thai và chia cho số bệnh nhân β-HCG dương tính;
(iv) tỷ lệ tổn thất trong thai là số lần mang thai sinh hóa
và sẩy thai tự phát chia cho số lượng β-HCG
bệnh nhân dương tính;
(v) tunel dương tỷ lệ này là số lượng bệnh nhân với DNA
phân mảnh> 10% chia cho số lần điều trị.
Phân tích thống kê được thực hiện với SPSS cho Windows phần mềm
gói phiên bản 10.1 (SPSS, Chicago, IL, USA). Các Kolmogorov-
test Smirnov đã được sử dụng để xác định xem các dữ liệu được lấy mẫu ngẫu nhiên
từ một phân bố bình thường. Các kiểm định chi bình phương hoặc Fisher chính xác
thử nghiệm đã được sử dụng để so sánh tỉ lệ có thai lâm sàng, sẩy thai
và tỷ lệ số lần điều trị ART trước đó trong các nhóm khác nhau