others (2004), Tanabe and others (2

others (2004), Tanabe and others (2007), and Jonker and oth- ers (2008) detected chicken and turkey species with the TaqMan probe method by using the mitochondrial cytb gene and Laube and others (2007) used the interleukin-2 precursor gene to identify of these species. To our knowledge, in poultry meat identification, there have been no reports on the use of real-time PCR analysis of the mitochondrial NADH dehydrogenase subunit 2 (ND2) gene, which has sufficient degrees of mutation in many plants and an- imals. Therefore, the aim of this study was to develope real-time PCR assays, by using mitochondrial ND2 gene variability, for the more reliable and sensitive detection of chicken and turkey meat in raw and heat-treated meat mixtures.

Materials and Methods

Preparation of meat mixtures
Tissue from the skeletal muscle of chicken (Gallus gallus), turkey (Meleagris gallopavo) horse (Equus caballus), donkey (Equus asinus), pork (Sus scrofa domesticus), cattle (Bos taurus), and sheep (Ovis aries) were used. Binary meat mixtures, containing chicken and turkey meat ranging from 0.001% to 10% levels (corresponding range of 0.001 to 10 ng target DNA), were prepared within a beef mixture. To eliminate errors that usually occur during blending, beef was added to the mixture at a level of approximately 50% in each batch and blended for 2 min to obtain a thoroughly ho- mogeneous meat mixture each time when the target meats were diluted in the mixtures. Patties of approximately 20 g were pre- pared at every level of the binary mixtures and were subjected to
3 different heat treatments at 100, 150, and 200 ◦ C for 30 min in the oven after being covered with aluminium foil. Afterwards, DNA isolation was carried out on the raw and oven-cooked samples.

DNA isolation
To obtain a representative specimen, approximately 10 to 15 g raw and oven-cooked patty samples and pure meats from each species investigated were sampled in screw-top grinding jars and then powdered by using a mixer mill (Restch MM400, Germany) with a vibrational frequency of 30 Hz for 5 min after storing at –80 ◦ C overnight. The DNA was extracted from 25 mg of the powdered samples using a commercial kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to manufacturer’s protocol and the DNA concentration was measured by the spectrophotometric method (Heptinstall and Rapley 2002).

Oligonucleotide primers and probes
Chicken and turkey specific primers and probe sets were de- signed using the mitochondrial ND2 (NADH dehydrogenase sub- unit 2) gene DNA sequence following the alignment of available sequences from the GenBank database with Clustal W (version
1.8). (Higgins and others 1992) (Figure 1). In addition, common sense and antisense primers and a probe set that was common to both mammalian and poultry were used to amplify a conserved region of 74 bp of the 16 sRNA gene to act as a control of am- plificability and false negativity on the PCR results (Kesmen and others 2009). Primers and probes, labelled 5-carboxyfluorescein (FAM) and 3 fluorescent quencher (TAMRA), were purchased from Metabion (Martinsried, Germany).

Kết quả (Việt) 1:

những người khác (2004), Tanabe và những người khác (2007), và Jonker và oth-ers (2008) phát hiện gà và Thổ Nhĩ Kỳ loài với TaqMan phương pháp thăm dò bằng cách sử dụng các gen ti thể cytb và Laube và những người khác (2007) sử dụng interleukin-2 tiền thân của gen để nhận dạng của các loài này. Để kiến thức của chúng tôi, trong các nhận dạng thịt gia cầm, đã có không có báo cáo về việc sử dụng thời gian thực Đảng Cộng sản Romania phân tích của tiểu đơn vị dehydrogenase NADH ti thể 2 (ND2) gen, mà đã đủ độ khác nhau của đột biến trong nhiều loài thực vật và một - imals. Do đó, mục đích của nghiên cứu này là phát triển thời gian thực Đảng Cộng sản Romania thử nghiệm, bằng cách sử dụng các biến đổi gen ND2 ti thể, để phát hiện hơn đáng tin cậy và nhạy cảm của thịt gà và gà tây trong hỗn hợp thịt nguyên và nhiệt.Vật liệu và phương phápChế tạo hỗn hợp thịtMô từ cơ xương gà (Gallus gallus), Thổ Nhĩ Kỳ (Meleagris gallopavo) ngựa (Equus nhà), lừa (Equus asinus), thịt lợn (Sus scrofa domesticus), bò (Bos taurus) và cừu (Ovis aries) đã được sử dụng. Hỗn hợp thịt nhị phân, có thịt gà và gà tây thịt khác nhau, từ 0,001% đến 10% mức (phạm vi tương ứng của mục tiêu của 0,001-10 DNA), đã được chuẩn bị trong một hỗn hợp thịt bò. Để loại bỏ các lỗi thường xảy ra trong trộn, thịt bò đã được thêm vào hỗn hợp ở mức khoảng 50% trong mỗi lô và pha trộn cho 2 phút để có được một kỹ lưỡng ho-mogeneous hỗn hợp thịt mỗi thời gian khi các loại thịt mục tiêu đã được pha loãng trong các hỗn hợp. Patties của khoảng 20 g được trước pared ở mọi cấp độ của hỗn hợp nhị phân và đã phải chịu để3 điều trị nhiệt khác nhau ở 100, 150 và 200 ◦ C trong 30 phút vào lò nướng sau khi được che phủ bằng nhôm lá mỏng. Sau đó, cô lập DNA được thực hiện trên các mẫu nguyên và nấu chín lò nướng.Cô lập DNAĐể có được một mẫu đại diện, khoảng 10-15 g nguyên và nấu chín lò patty mẫu và các loại thịt tinh khiết từ mỗi loài điều tra được lấy mẫu trong vít-đầu mài lọ và sau đó bột bằng cách sử dụng một nhà máy trộn (Restch MM400, Đức) với một tần số vibrational của 30 Hz cho 5 phút sau khi lưu trữ tại –80 ◦ C qua đêm. DNA được chiết xuất từ 25 mg của bột mẫu bằng cách sử dụng một bộ thương mại (Qiagen, Hilden, Đức) theo giao thức của nhà sản xuất và nồng độ DNA đã được đo bằng phương pháp spectrophotometric (Heptinstall và Rapley năm 2002).Oligonucleotide chất nền, mồi và đầu dòGà và Thổ Nhĩ Kỳ cụ thể chất nền, mồi và thăm dò bộ đã là de-đăng bằng cách sử dụng ti thể ND2 (NADH dehydrogenaza sub-đơn vị 2) gen trình tự ADN sau liên kết chuỗi có sẵn từ cơ sở dữ liệu GenBank với Clustal W (Phiên bản1. 8). (Higgins và những người khác năm 1992) (hình 1). Ngoài ra, phổ biến ý thức và antisense chất nền, mồi và bộ thăm dò đã được phổ biến cho cả hai mammalian và gia cầm được sử dụng để khuyếch đại một khu vực bảo tồn của 74 bp của gen sRNA 16 để hoạt động như một điều khiển của am-plificability và giả tiêu cực trên các kết quả Đảng Cộng sản Romania (Kesmen và những người khác năm 2009). Chất nền, mồi và đầu dò, dán nhãn 5-carboxyfluorescein (FAM) và 3 huỳnh quang quencher (TAMRA), đã được mua từ Metabion (Martinsried, Đức).

Kết quả (Việt) 2:

những người khác (2004), Tanabe và những người khác (2007), và Jonker và ers oth- (2008) phát hiện gà và gà tây loài với các phương pháp thăm dò TaqMan bằng cách sử dụng các gen ty thể cytb và Laube và những người khác (2007) sử dụng các interleukin-2 tiền thân gen để xác định các loài này. Theo hiểu biết của chúng tôi, trong việc xác định thịt gia cầm, chưa có báo cáo về việc sử dụng các phân tích PCR thời gian thực của NADH dehydrogenase ti thể tiểu đơn vị 2 (ND2) gen, trong đó có đủ độ đột biến trong nhiều nhà máy và imals An-. Do đó, mục đích của nghiên cứu này là để phát triển các xét nghiệm PCR thời gian thực, bằng cách sử dụng biến đổi gen ND2 ty thể, để phát hiện đáng tin cậy hơn và nhạy cảm của gà thịt và gà tây trong hỗn hợp thịt sống và được xử lý nhiệt. Vật liệu và phương pháp chuẩn bị thịt hỗn hợp mô từ cơ xương của gà (Gallus gallus), gà tây (meleagris gallopavo) Ngựa (Equus caballus), lừa (Equus asinus), thịt lợn (Sus scrofa domesticus), gia súc (Bos taurus), và cừu (Ovis aries) là sử dụng. Hỗn hợp thịt nhị phân, có chứa thịt gà và thịt gà tây từ 0,001% đến 10% mức (phạm vi tương ứng của ,001-10 ng DNA mục tiêu), đã được chuẩn bị trong vòng một hỗn hợp thịt bò. Để loại bỏ các lỗi thường xảy ra trong quá trình trộn, thịt bò đã được thêm vào hỗn hợp ở mức xấp xỉ 50% trong mỗi mẻ và pha trộn trong 2 phút để có được một hỗn hợp thịt mogeneous triệt ho- mỗi lần khi các loại thịt mục tiêu đã được pha loãng trong hỗn hợp . Bánh rán nhỏ khoảng 20 g đã được chuẩn bị ở mọi cấp độ của hỗn hợp nhị phân và đã phải chịu 3 phương pháp điều trị khác nhau ở nhiệt độ 100, 150, và 200 ◦ C trong 30 phút trong lò sau khi được phủ bằng lá nhôm. Sau đó, cô lập DNA được thực hiện trên các mẫu nguyên liệu và lò nấu. phân lập DNA Để có được một mẫu đại diện, khoảng 10-15 g mẫu patty liệu và lò nấu chín và thịt nguyên chất từ mỗi loài tra được lấy mẫu trong vít-top nghiền lọ và sau đó nghiền thành bột bằng cách sử dụng một máy trộn (Restch MM400, Đức) với một tần số rung động của 30 Hz cho 5 phút sau khi lưu trữ ở -80 ◦ C qua đêm. DNA được chiết xuất từ 25 mg của các mẫu bột sử dụng một bộ thương mại (Qiagen, Hilden, Đức) theo giao thức của nhà sản xuất và nồng độ DNA được đo bằng phương pháp quang phổ (Heptinstall và Rapley 2002). mồi oligonucleotide và thăm dò gà và gà tây mồi cụ thể và bộ dò được de- ký sử dụng ND2 ty lạp thể (NADH dehydrogenase tiểu đơn vị 2) trình tự DNA gen sau sự liên kết của các trình tự có sẵn từ các cơ sở dữ liệu GenBank với Clustal W (phiên bản 1.8). (Higgins và những người khác 1992) (Hình 1). Ngoài ra, ý thức và antisense mồi phổ biến và một bộ dò mà là chung cho cả động vật có vú và gia cầm đã được sử dụng để khuếch đại một khu vực được bảo vệ của 74 bp của gen 16 Srna để hoạt động như một điều khiển của plificability am- và tiêu cực sai trên PCR kết quả (Kesmen và những người khác 2009). Mồi và đầu dò, có nhãn 5 carboxyfluorescein (FAM) và 3 thức uống huỳnh quang (Tamra), được mua từ Metabion (Martinsried, Đức).