Escherichia coli BL21(DE3)pLysS cel

Escherichia coli BL21(DE3)pLysS cells were purchased
from Novagen. The pTaCHL bacterial expression construct
for N-terminally hexahistidine-tagged wheat chlorophyllase
was described previously [23]. HIS-Select resin and
HIS-Select integrated Lysis and AYnity PuriWcation
(iLAP) 96-well plates were bought from Sigma–Aldrich.
The bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit was
obtained from Pierce. Chlorophyll was prepared from spinach
leaves [23]. All other reagents were purchased from
either Research Organics or Sigma–Aldrich.
Bacterial expression of wheat chlorophyllase
Escherichia coli BL21(DE3)pLysS cells were transformed
with the pTaCHL expression vector. For aYnitycolumn
chromatography, cells were grown in 1L of TerriWc
broth (37 °C) containing 50 gmL¡1 kanamycin until
A600nmD0.8. Expression was induced by addition of 1mM
isopropyl-1-thio--D-galactopyranoside (IPTG). After 6 h
(20 °C), cells were pelleted by centrifugation (10,000g;
10min). Hexahistidine-tagged wheat chlorophyllase was
puriWed by Ni2+-aYnity column chromatography, as
reported [23]. For iLAP plate puriWcation of hexahistidinetagged
wheat chlorophyllase, cells (100mL) were grown in
TerriWc broth (37 °C) containing kanamycin (50 gmL¡1),
as above. Following addition of 1mM IPTG, the growth
temperature was reduced to 20 °C. Cells were harvested
after 6 h by centrifugation (10,000g; 10min).
Integrated lysis and puriWcation of wheat chlorophyllase in
96-well format
The iLAP plates (Sigma–Aldrich) are coated with a cell
lysis reagent and a nickel chelate matrix, allowing for cell
lysis and protein capture in a single step. Pelleted cells were
resuspended in 50mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane
(Tris) (pH 8) buVer, 500mM NaCl, 20mM imidazole, and
10% (v/v) glycerol. The volume used for resuspension was
varied to determine optimal protein yield. Cell suspension
(0–0.2mL) was loaded per well of an iLAP plate. For cell
lysis, resuspended samples were incubated overnight (4 °C)
on a nutating mixer. A series of washes removes the lysis
reagent from the well. First, each well was washed four
times with 0.3mL of 50mM Tris (pH 8), 500mM NaCl,
20mM imidazole, and 0.05% (v/v) Tween 20. Second, wells
were washed four times with 0.3mL of 50mM Tris (pH 8),
20mM imidazole, and 500mM NaCl. The amount of protein
bound per well was determined using the BCA Protein
Assay (Pierce) with bovine serum albumin as a standard.
Enzyme assays
Assays for the dephytylation of chlorophyll were performed
in a standard system of 100mM 3-(N-morpholino)-
2-hydroxypropanesulfonic acid (Mopso) buVer (pH 7) and
0.2mM chlorophyll in acetone (20% Wnal volume) [2,23].
Assays were performed at 25 °C with rapid shaking
(285rpm). Reaction progress was quenched with 4:6:1 (v/v/v)
acetone:heptane:KOH (1N). After mixing, the reactions
were centrifuged to separate the organic and aqueous
phases. The amount of chlorophyllide in the aqueous phase
was analyzed spectrophotometrically [2,23].
A continuous plate-based assay for the carboxylesterase
activity of chlorophyllase was developed using either PNPbutyrate
or PNP-decanoate as substrate [23]. Solutions of
PNP-esters were prepared in acetonitrile. The standard
assay mix contained 100mM Tris–HCl (pH 8) buVer, 5mM
PNP-ester, and 10% (v/v) acetonitrile. Assays performed in
iLAP plates were initiated by addition of assay mix
(200 L) to wells containing bound protein. Rates of chlorophyllase
hydrolysis of PNP substrates were determined at
25 °C by monitoring the increase in absorbance of the
p-nitrophenoxide product (A405nm; D18,200M¡1 cm¡1)
versus time on a SpectraMax Plus 96-well plate reader. All
reaction rates were corrected for nonenzymatic hydrolysis
of the substrate. Kinetic parameters for PNP-butyrate or
PNP-decanoate were determined at varied substrate concentrations
(0–5mM) in the standard assay mix. The resulting
data were Wtted to vDkcat[S]/(Km+[S]) using
Kaleidagraph (Synergy Software).

Kết quả (Việt) 1:

Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS tế bào đã được muatừ Novagen. Biểu thức vi khuẩn pTaCHL xây dựngcho N nan y lúa mì dán hexahistidine chlorophyllaseđược miêu tả trước đó [23]. Chọn HIS nhựa vàHIS-chọn tích hợp Lysis và AYnity PuriWcation(iLAP) 96-cũng tấm được mua từ Sigma-Aldrich.Các bicinchoninic axit (BCA) protein khảo nghiệm kit làthu được từ Pierce. Chất diệp lục đã được chuẩn bị từ rau binalá [23]. Tất cả các thuốc thử khác đã được mua từnghiên cứu chất hữu cơ hoặc Sigma-Aldrich.Các biểu hiện do vi khuẩn của lúa mì chlorophyllaseEscherichia coli BL21 (DE3) pLysS tế bào đã được chuyển đổivới pTaCHL biểu hiện vector. Cho aYnitycolumnsắc kí, tế bào đã được trồng trong 1L TerriWccanh (37 ° C) có chứa 50 gmL¡1 kanamycin cho đến khiA600nmD0.8. biểu hiện được gây ra bởi các bổ sung 1 mmisopropyl-1-thio--D-galactopyranoside (IPTG). Sau khi 6 h(20 ° C), tế bào đã được pelleted bởi số (10, 000g;10 phút). là lúa mì dán Hexahistidine chlorophyllasepuriWed bởi Ni2 +-aYnity cột sắc kí, nhưbáo cáo [23]. Cho iLAP tấm puriWcation của hexahistidinetaggedlúa mì chlorophyllase, tế bào (100mL) được trồng ởTerriWc canh (37 ° C) có chứa kanamycin (50 gmL¡1),như trên. Sau các bổ sung 1 mm IPTG, sự tăng trưởngnhiệt độ đã được giảm xuống 20 ° C. Tế bào đã được thu hoạchsau khi 6 h số (10, 000g; 10 phút).Tích hợp lysis và puriWcation của lúa mì chlorophyllase trong96-cũng định dạngILAP tấm (Sigma-Aldrich) được phủ một tế bàolysis tinh khiết và một ma trận chelate niken, cho phép cho di độnglysis và protein chụp trong một bước duy nhất. Pelleted tế bào đãresuspended trong 50mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane(Tris) (pH 8) buVer, 500mM NaCl, imidazole 20mM, vàNhóm glycerol 10% (v/v). Khối lượng được sử dụng cho resuspensionkhác nhau để xác định sản lượng tối ưu protein. Hệ thống treo di động(0-0,2 mL) được nạp mỗi tốt của một tấm iLAP. Cho di độnglysis, resuspended mẫu đã được ủ qua đêm (4 ° C)trên một máy trộn nutating. Một loạt các rửa loại bỏ lysistinh khiết từ giếng. Trước tiên, mỗi cũng có được rửa bốnthời gian với cách 0.3mL 50mM Tris (pH 8), 500mM NaCl,imidazole 20mM, và 0,05% (v/v) Tween 20. Thứ hai, wellsđã được rửa sạch bốn lần với cách 0.3mL 50mM Tris (pH 8),imidazole 20mM, và 500mM NaCl. Số tiền của proteinràng buộc một cũng đã được xác định bằng cách sử dụng các Protein BCAKhảo nghiệm (Pierce) với bò huyết thanh albumin như một tiêu chuẩn.Enzyme thử nghiệmThử nghiệm cho dephytylation của chất diệp lục được thực hiệntrong một hệ thống tiêu chuẩn của 100mM 3-(N-morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic axít (Mopso) buVer (pH 7) vàcách 0.2mM chất diệp lục trong axeton (20% khối lượng Wnal) [2,23].Thử nghiệm đã được thực hiện ở 25 ° C với nhanh chóng lắc(285 rpm). phản ứng tiến bộ đã được quenched với 4:6:1 (v/v/v)Acetone: heptan: KOH (1N). Sau khi trộn, các phản ứngđã ly tách biệt hữu cơ và dung dịch nướcgiai đoạn. Số lượng chlorophyllide trong dung dịch nước phađược phân tích spectrophotometrically [2,23].Một khảo nghiệm dựa trên tấm liên tục cho carboxylesterasehoạt động của chlorophyllase đã được phát triển bằng cách sử dụng một trong hai PNPbutyratehoặc PNP-decanoate là chất nền [23]. Giải pháp củaPNP – Este đã được chuẩn bị tại acetonitrile. Các tiêu chuẩnkhảo nghiệm kết hợp chứa 100mM Tris-HCl (pH 8) buVer, 5mMPNP – ester, và 10% (v/v) acetonitrile. Thử nghiệm thực hiện trongiLAP tấm đã được khởi xướng bởi các bổ sung của khảo nghiệm hỗn hợp(200 L) để wells có chứa protein ràng buộc. Tỷ giá của chlorophyllasethủy phân PNP chất đã được xác định tại25 ° C bằng cách giám sát sự gia tăng hấp thu của cácsản phẩm p-nitrophenoxide (A405nm; D18, 200M¡1 cm¡1)so với thời gian trên một tấm SpectraMax Plus 96-tốt đọc. Tất cảtỷ lệ phản ứng đã được chỉnh sửa cho nonenzymatic thủy phâncủa bề mặt. Các tham số động lực cho PNP-butyrate hoặcPNP – decanoate đã được xác định ở nồng độ chất nền khác nhau(0-5 mM) trong hỗn hợp tiêu chuẩn khảo nghiệm. Các kết quảdữ liệu đã là Wtted để vDkcat[S]/(Km+[S]) bằng cách sử dụngKaleidagraph (sức mạnh tổng hợp phần mềm).

Kết quả (Việt) 2:

Escherichia coli BL21 (DE3) tế bào pLysS được mua
từ Novagen. Các biểu hiện vi khuẩn pTaCHL xây dựng
cho N-nan-hexahistidine tagged chlorophyllase lúa mì
đã được mô tả trước đây [23]. HIS-Select nhựa và
HIS-Select tích hợp ly giải và AYnity PuriWcation
(iLAP) Tấm 96 cũng đã được mua từ Sigma-Aldrich.
Các axit bicinchoninic (BCA) kit xét nghiệm protein được
lấy từ Pierce. Chất diệp lục được chế biến từ rau bina
lá [23]. Tất cả các thuốc thử khác được mua từ
một trong hai nghiên cứu Organics hoặc Sigma-Aldrich.
biểu hiện vi khuẩn của chlorophyllase mì
Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS tế bào đã được biến đổi
với vector biểu hiện pTaCHL. Đối aYnitycolumn
sắc ký, các tế bào được nuôi cấy trong 1L của TerriWc
canh (37 ° C) có chứa 50 gmL¡1 kanamycin cho đến?
A600nmD0.8. Biểu hiện được cảm ứng bằng cách thêm 1mm
isopropyl-1-thio -? - D-galactopyranoside (IPTG). Sau 6 h
(20 ° C), các tế bào được ăn viên bằng cách ly tâm (10,000g;
10min). Chlorophyllase mì Hexahistidine gắn thẻ được
puriWed bằng sắc ký cột Ni2 + -aYnity, như
báo cáo [23]. Đối iLAP tấm puriWcation của hexahistidinetagged
chlorophyllase lúa mì, các tế bào (100ml) được trồng trong
TerriWc canh (37 ° C) có chứa kanamycin (50? gmL¡1),
như trên. Ngoài ra sau 1mm IPTG, sự tăng trưởng
giảm nhiệt độ xuống đến 20 ° C. Các tế bào được thu hoạch
sau 6 h bằng ly tâm (10,000g; 10min).
lysis tích hợp và puriWcation của chlorophyllase lúa mì trong
96 giếng format
Các tấm iLAP (Sigma-Aldrich) được phủ bằng một tế bào
thuốc thử ly giải và một ma trận nickel chelate, cho phép tế bào
ly giải protein và chụp trong một bước duy nhất. Tế bào ăn viên được
lơ lửng trong 50mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane
(Tris) (pH 8) buVer, 500mm NaCl, 20mm imidazole, và
10% (v / v) glycerol. Khối lượng được sử dụng để khuấy động ở cột được
thay đổi để xác định sản lượng protein tối ưu. Treo tế bào
(0-0.2mL) đã được nạp mỗi giếng của một tấm iLAP. Đối với tế bào
ly giải, mẫu lơ lửng được ủ qua đêm (4 ° C)
vào một máy trộn nutating. Một loạt các chất rửa loại bỏ các ly giải
chất phản ứng từ giếng. Thứ nhất, mỗi cũng được rửa bốn
lần với 0.3mL của 50mM Tris (pH 8), 500mm NaCl,
20mm imidazole, và 0,05% (v / v) Tween 20. Thứ hai, giếng
được rửa bốn lần với 0.3mL của 50mM Tris ( pH 8),
20mm imidazole, và 500mm NaCl. Lượng protein
ràng buộc mỗi giếng đã được xác định bằng cách sử dụng Protein BCA
Assay (Pierce) với albumin huyết thanh bò như một tiêu chuẩn.
Enzyme xét nghiệm
Xét nghiệm cho dephytylation của chất diệp lục được thực hiện
trong một hệ thống tiêu chuẩn 100mm 3- (N-morpholino) -
2 axit -hydroxypropanesulfonic (Mopso) buVer (pH 7) và
0.2mm chất diệp lục trong axeton (20% khối lượng Wnal) [2,23].
Xét nghiệm được thực hiện ở 25 ° C với nhanh chóng lắc
(285rpm). Tiến độ phản ứng đã được dập tắt với 4: 6: 1 (v / v / v)
acetone: heptan: KOH (1N). Sau khi trộn, các phản ứng
được ly tâm để tách các hữu cơ và dung dịch nước
giai đoạn. Lượng chlorophyllide trong pha nước
được phân tích quang phổ [2,23].
Một thử nghiệm tấm dựa trên liên tục cho các carboxylesterase
hoạt động của chlorophyllase đã được phát triển bằng cách sử dụng PNPbutyrate
hoặc PNP-decanoate như đế [23]. Giải pháp của
PNP-este đã được chuẩn bị trong acetonitrile. Các tiêu chuẩn
kết hợp khảo nghiệm chứa 100mm Tris-HCl (pH 8) buVer, 5mm
PNP-ester, và 10% (v / v) acetonitrile. Xét nghiệm được thực hiện trong
tấm iLAP đã được khởi xướng bởi ngoài khảo nghiệm kết hợp
(200? L) để giếng có chứa protein ràng buộc. Giá của chlorophyllase
thủy phân của PNP chất đã được xác định ở
25 ° C bằng cách giám sát việc tăng hấp thụ của các
sản phẩm p-nitrophenoxide (A405nm;? D18,200M¡1 cm¡1)
theo thời gian trên SpectraMax Cộng với đầu đọc đĩa 96 giếng. Tất cả
tốc độ phản ứng đã được điều chỉnh cho quá trình thủy phân nonenzymatic
của chất nền. Thông số động học cho PNP-butyrate hoặc
PNP-decanoate được xác định ở nồng độ chất nền khác nhau
(0-5mM) trong hỗn hợp khảo nghiệm tiêu chuẩn. Kết quả là
dữ liệu đã được Wtted để vDkcat [S] / (Km + [S]) sử dụng
Kaleidagraph (Synergy Software).