Detection of the Newcastle disease

Detection of the Newcastle disease virus and its effect on development
of post-vaccination immunity in a commercial flock of laying hens
Jana Jeřábková1, Růžena Juranová2, Kateřina Rosenbergová3,4, Libuše Kulíková2,
Alfred Hera1, Petr Lány3,4, Oldřich Kubíček4, Josef Koláček5
1Institute for State Control of Veterinary Biologicals and Medicines, Brno, Czech Republic
2Avian and Exotic Animal Clinic, 3Department of Infectious Diseases and Epidemiology,
Faculty of Veterinary Medicine, University of Veterinary and Pharmaceutical Science Brno, Czech Republic
4National Institute for Nuclear, Chemical and Biological Protection, Kamenna, Czech Republic
5Company Proagro Nymburk a.s., department Opatovice, Czech Republic
Received March 31, 2011
Accepted February 14, 2012
Abstract
The aim of this study was to monitor the concentration of antibodies against Newcastle disease
after vaccination of laying hens at the beginning and in the end of the laying period. The study
was carried out in one commercial flock of laying hens in Opatovice in the Czech Republic in
the years 2008–2010. A total of 280 samples of blood sera were taken from laying hens coming
from four poultry houses. The sera were tested by the haemagglutination inhibition test according
to the OIE Manual. Virological testing was conducted as a consequence of atypical results of
serological testing. Newcastle disease virus RNA was proved by the RT-nested PCR method
in the pooled tissue samples of 5 hens, in the samples of intestines with ileocaecal tonsila, in
trachea and also in one swab sample from the environment of one house. Based on sequencing
analysis and subsequent phylogenetic analysis, the virus was identified as a low pathogenic strain
of paramyxovirus (PMV-1). This low pathogenic strain did not have any impact on the health of
laying hens.
Poultry, antibodies, RT-nested PCR, sequencing
Newcastle disease (ND) is an infectious, highly contagious viral disease of the
gallinaceous fowl affecting all age categories, caused by the Newcastle disease virus
(NDV) belonging to the family Paramyxoviridae (PMV-1), genus Avulavirus. Viral
genome is non-segmented, formed by a single stranded RNA with negative polarity
(-ss RNA), coding for six proteins: NP - nucleoprotein, M - matrix protein, F - fusion
protein, HN - haemagglutinin-neuraminidase protein, P - phosphorylated nucleocapsideassociated
protein and L-RNA-dependent RNA polymerase (Kattenbelt et al. 2006).
The virulence of the NDV is closely related to the variable cleavability of the F protein
due to distinct amino acid composition of the “cleavage site” (L e e et al. 2004; de
Leeuw et al. 2005). Studies comparing amino acid sequences of the F protein proved
that strains which are virulent for poultry have the 112R/K-R-Q-K/R-R-F117 amino acid
sequence at the “cleavage site”, whereas low virulence strains have the 112G/E-K/RQ-
G/E-R-L117 sequence in this area (Collins et al. 1993; L i u et al. 2003). Antigenic
diversity of paramyxoviruses was confirmed in Australia between 1998–2000 (Annex
to the EFSA Journal 2007).
Newcastle disease has a big socio-economic impact (Awan et al. 1994; Alexander
2000; S e a l et al. 2000). Significant variability of clinical symptoms, which depends
on the virulence of ND virus strains, is typical for this disease. Lentogenic virus
strains cause only mild or no clinical symptoms, in particular in the adult birds,
while the mesogenic strains cause higher mortality. Velogenic strains cause severe gastrointestinal, respiratory and/or nervous symptoms and mortality rate reaches
almost 100% (B anerjee et al. 1994).
Despite the antibody titres, infected hens excrete the virus via faeces; the virus is then
transmitted transovarially into the eggs and infected chickens subsequently hatch from such
eggs (Capua et al. 1993). The transmission of the NDV lentogenic strains were shown by
Pospíšil et al. 1991 who detected the virus directly in the embryos of hatching eggs and in
the intestinal contents of the non-vaccinated chickens up to 25 days after hatching, despite
the fact that the parental flock was vaccinated and the specific maternal antibodies were
present in the chickens. Newcastle disease virus disappeared from the chickens with no
induction of the active production of antibodies; these chickens reacted to the vaccination
by only very low and variable titres of antibodies.
The prevention mainly relies on flock protection from the appearance and spread of
the infection into the flocks and on the specific ND immunoprophylaxis. The chickens
are vaccinated using live vaccines usually 2–3 ×, and around the age of 18 weeks they
are revaccinated with inactivated vaccine with the aim to ensure the protection of laying
hens until the end of the laying period. Cases of a lack of post-vaccination immunity
against ND were reported in 2007 and 2008 despite these measures being in place.
This led us to monitor the post-vaccination antibodies and to the virological testing
of laying hens to identify the causes for the unusual development of post-vaccination
immunity.
Materials and Methods
Sample collection
The monitoring of antibodies against ND was carried out in a commercial flock of laying hens in Opatovice
in the Czech Republic. There were 9 poultry houses, from which 4 poultry houses (No. 2, 4, 8 and 10) has been
chosen for monitoring. Three different types of the laying hybrid hens were kept in these poultry houses: the type
Isa Brown in house No. 2 with the count of 40 800 hens and in house No. 4 with the count of 26 880 hens, the
type Lohmann Brown-Lite in house No. 8 with the count of 42 000 hens and the type Hisex brown in house No.
10 with the count of 62 560 hens.
The chickens were vaccinated twice by the live vaccine against ND in 2007 and 2008. The first vaccination by
vaccine Avinew with strain VG/GA at 4 weeks of age and the second vaccination by the same vaccine in eight
weeks of age (both live vaccines were administered in drinking water). In 2009, the first vaccination was done by
the vaccine Avipro HB1 with the strain HB1 at 4 weeks of age; the second vaccination was done by the vaccine
Avipro LaSota with the strain LaSota at 8 weeks of age (both live vaccines were administered in drinking water).
Before the start of the laying period, at 14 weeks of age, the chickens were re-vaccinated by the inactivated
vaccine against ND: vaccine Gallimune 302 ND-IB-EDS, ND strain Ulster 2C in the years 2007 and 2008;
vaccine Cevac IB-ND-EDS K, ND strain LaSota in 2009).
In the years 2008–2010, a total of 280 blood samples were taken from the commercial laying hens and
tested for the ND post-vaccination immunity. In 2008, the group of hens in house No. 4 was monitored during
the laying period; 20 blood samples were taken at 23, 35, 53 and 71 weeks of age, a total 80 samples. In the
same year, groups of hens from houses No. 2, 8 and 10 were monitored too; 20 blood samples were taken from
each house at the beginning of the laying period (around the age of 20 weeks) and at the end of the laying
period (around the age of 50 weeks). In 2009, the groups of hens from two poultry houses (No. 4 and 8) were
monitored again; 20 blood samples were taken from each house at the beginning of the laying period and before
the end of the laying period.
Haemagglutination inhibition test
The haemagglutination inhibition (HI) test was used for the detection of the presence of the antibodies against
NDV according to the OIE Manual (2010). This laboratory work was done at the State Veterinary Institute
Olomouc. Newcastle disease virus strain LaSota (originally from the vaccine Avipest) and NDV antiserum (VLA
Weybridge, UK) was used for HI test.
Virological testing
The tissue samples from 5 randomly selected hens from house No. 4 were used for the virological testing.
Brain, trachea, lungs, liver, kidney and caecum with ileocaecal tonsila were taken as the suspected organs. Five
swab samples (one sample from the ceiling fan, one sample from the rear fan, one sample from the side fan and
two samples from the feeders) from poultry house No. 4 were also taken in order to ensure a complete virological
investigation.
RNA extraction and Reverse transcriptase - nested polymerase chain reaction (RT-nested PCR)
Total RNA was isolated using RNeasy Mini Kit (Quiagen, Germany) according to the manufacturer’s
instructions. The F protein gene sequence (n. AY338284) acquired from the GenBank (NCBI) was used for
RT- nested PCR development. Two sets of primers based on a conserved region of the F protein gene of NDV
were designed. The sequence of a sense primer was 5´GAA AAA ACA CGG GTA GAA GA 3´, the sequence of
an antisense primer was 5´GAG CTG AGT TGG TTG TTC C 3´ for the RT-PCR and 5´GTC AAC ATA TAC
ACC TCA TCC CAG A 3´ and 5´GCA TTC TGG TTG GCT TGT ATC A 3´ for the nested PCR. The part of
amplification product from nested PCR (298 bp) is a sequence of the “cleavage site”. SYBR 1-STEP QRT-PCR
kit for a one-step RT-PCR (Invitrogen, USA) was used with a 20-ml mixture under the following conditions:
0.4 ml of RT/Taq Mix, 400 mM (each) dNTP and 1.6 mM MgCl2. Reverse transcription was performed with 3 ml
of total RNA at 42 °C for 50 min. The PCR amplification programme consisted of 40 cycles of 94 °C for 35 s,
followed by 47 °C for 35 s and 72 °C for 90 s. Finally, extension was at 72 °C for 5 min. PPP Master Mix (Top
Bio, Czech Republic) was used for nested PCR. PCR reaction was performed with 1 ml of amplification product
from RT-PCR. The PCR amplification programme consisted of 40 cycles of 94 °C for 35 s, followed by 54 °C for
35 s and 72 °C for 60 s. Finally, extension was at 72 °C for 5 min. The amplified products after nested PCR were
analysed by electrophoresis on a 2% agarose gel stained with ethidium bromide. The fragment size (298 bp) was
compared with the DNA ladder (O’Gene RulerTM DNA Ladder Mix, Fermentas, USA).
Sequencing of PCR product and phylogenetic analysis
The PCR product (298bp) was

Kết quả (Việt) 1:

Phát hiện vi-rút bệnh Newcastle và hiệu quả của nó về phát triểnsau khi tiêm chủng miễn dịch trong một đàn thương mại của gà mái đẻJana Jeřábková1, Růžena Juranová2, Kateřina Rosenbergová3, 4, Libuše Kulíková2,Alfred Hera1, Petr Lány3, 4, Oldřich Kubíček4, Josef Koláček51Institute nhà nước kiểm soát sinh phẩm thú y và các loại thuốc, Brno, Cộng hoà Séc2Avian và bệnh viện động vật kỳ lạ, 3Department của bệnh truyền nhiễm và dịch tễ học,Khoa thú y, đại học thú y và dược phẩm khoa học Brno, Cộng hoà Séc4National viện bảo vệ hạt nhân, hóa học và sinh học, Kamenna, Cộng hoà Séc5Company Proagro Nymburk a.s., tỉnh Opatovice, Cộng hoà SécNhận được Tháng ba, 2010Được chấp nhận tháng hai 14, 2012Tóm tắtMục tiêu của nghiên cứu này là theo dõi nồng độ của các kháng thể chống lại Newcastle bệnhsau khi tiêm phòng đẻ ở đầu và cuối cùng của thời kỳ đẻ. Nghiên cứuđược thực hiện trong một đàn thương mại đẻ ở Opatovice tại cộng hòa Séc ởnăm 2008-2010. Tổng cộng 280 các mẫu huyết thanh máu được lấy từ đẻ đếntừ bốn gia cầm nhà. Các huyết thanh đã được thử nghiệm bởi haemagglutination ức chế thử nghiệm theođể hướng dẫn sử dụng OIE. Virological thử nghiệm được tiến hành do hậu quả của các kết quả không điển hình củathử nghiệm serological. Newcastle bệnh virus RNA đã được chứng minh bằng phương pháp PCR RT lồng nhautrong mẫu những mô của gà mái 5, trong mẫu ruột với ileocaecal tonsila, trongkhí quản và cũng tại một tăm bông mẫu từ môi trường của một ngôi nhà. Dựa trên trình tựphân tích và phân tích phát sinh loài tiếp theo, các vi-rút được xác định là một chủng gây bệnh thấpcủa paramyxovirus (PMV-1). Này căng thẳng gây bệnh thấp không có bất kỳ tác động về sức khỏe củagà mái đẻ.Gia cầm, kháng thể, đã xếp lồng RT Đảng Cộng sản Romania, xác định trình tựNewcastle bệnh (ND) là một bệnh truyền nhiễm, rất dễ lây lan truyền của cácgallinaceous gà ảnh hưởng đến tất cả các loại tuổi, gây ra bởi virus bệnh Newcastle(NDV) thuộc về gia đình Paramyxoviridae (PMV-1), chi Avulavirus. Virusbộ gen là không-phân đoạn, hình thành bởi một RNA đang bị kẹt lại duy nhất với tiêu cực cực(-ss RNA), mã hóa cho protein sáu: NP - nucleoprotein, M - ma trận protein, F - phản ứng tổng hợpprotein, HN - haemagglutinin-neuraminidase protein, P - phosphorylated nucleocapsideassociatedprotein và L RNA phụ thuộc vào RNA polymerase (Kattenbelt et al. 2006).Virulence NDV chặt chẽ liên quan đến cleavability biến của F proteindo axít amin khác biệt thành phần của cleavage "trang web" (L e e et al. năm 2004; deLeeuw et al. 2005). Nghiên cứu so sánh trình tự axit amin của F protein chứng minhchủng có độc cho chăn nuôi gia cầm có axit amin 112R/K-R-Q-K/R-R-F117trình tự tại "cleavage trang web", trong khi thấp virulence chủng có 112G/E-K/RQ-G/E-R-L117 trình tự trong lĩnh vực này (Collins et al. 1993; L tôi u et al. năm 2003). Kháng nguyênsự đa dạng của paramyxoviruses đã được xác nhận tại Úc giữa năm 1998-2000 (phụ lụcEFSA tạp chí 2007).Newcastle bệnh đã tác động kinh tế xã hội lớn (Awan et al. 1994; Alexandernăm 2000; S e một l et al. năm 2000). Nhiều thay đổi quan trọng của triệu chứng lâm sàng, phụ thuộcNgày virulence ND virus chủng, là điển hình cho bệnh này. Vi-rút Lentogenicchủng gây chỉ nhẹ hoặc không có triệu chứng lâm sàng, đặc biệt trong những con chim dành cho người lớn,trong khi mesogenic chủng gây ra tỷ lệ tử vong cao. Velogenic chủng gây ra các triệu chứng nặng của đường tiêu hóa, hô hấp và/hoặc lo lắng và đạt đến tỉ lệ tử vonggần 100% (B anerjee et al. 1994).Mặc dù titres kháng thể, bị nhiễm gà mái bài tiết virus thông qua phân; các vi-rút là sau đótruyền transovarially vào trứng và gà bị nhiễm bệnh sau đó đã nở từ như vậytrứng (Capua et al. năm 1993). Việc truyền giống lentogenic NDV đã được thể hiện bởiPospíšil et al. 1991 phát hiện virus trực tiếp trong phôi trứng nở và trongnội dung ruột gà không tiêm phòng tối đa 25 ngày sau khi nở, mặc dùthực tế là các đàn của cha mẹ đã được tiêm phòng và các kháng thể cụ thể bà mẹ đãhiện diện trong những con gà. Newcastle bệnh virus đã biến mất từ những con gà không cócảm ứng của hoạt động sản xuất kháng thể; những con gà đã phản ứng để tiêm chủngbởi chỉ rất thấp và biến titres của các kháng thể.Công tác phòng chống chủ yếu dựa vào đàn bảo vệ từ xuất hiện và lây lan củanhiễm trùng vào các đàn gia cầm và trên ND immunoprophylaxis cụ thể. Những con gàđược tiêm phòng bằng cách sử dụng vắc-xin sống thường 2-3 ×, và xung quanh thành phố tuổi 18 tuần họđược revaccinated với gan vắc xin với mục đích đảm bảo bảo vệ đặtgà mái cho đến cuối giai đoạn đẻ. Trường hợp của một thiếu miễn dịch tiêm phòng sauchống lại ND đã được báo cáo trong năm 2007 và 2008 bất chấp những biện pháp đang tại chỗ.Điều này dẫn chúng tôi để giám sát các kháng thể sau tiêm phòng và để thử nghiệm virologicalđẻ ý để xác định những nguyên nhân cho sự phát triển bất thường của Post-tiêm phòngkhả năng miễn dịch.Vật liệu và phương phápBộ sưu tập mẫuGiám sát của các kháng thể chống lại ND được thực hiện trong một đàn thương mại của gà mái đẻ ở Opatovicetại cộng hòa Séc. Đã có 9 nhà chăn nuôi gia cầm, từ đó gia cầm 4 nhà (số 2, 4, 8 và 10) đãchọn để theo dõi. Ba loại khác nhau của lai đẻ được giữ trong các nhà chăn nuôi gia cầm: các loạiIsa Brown trong nhà số 2 đếm 40 800 gà mái và trong nhà số 4 với đếm 26 880 gà mái, cácgõ Lohmann Brown-Lite trong nhà số 8 với số của gà mái 42 000 và các loại Hisex brown trong nhà số10 với số 62 560 gà mái.Những con gà đã được tiêm phòng hai lần bởi vắc ND, sống trong năm 2007 và 2008. Tiêm chủng đầu tiên bởivắc xin Avinew với căng thẳng VG/GA 4 tuần tuổi và tiêm phòng thứ hai của thuốc chủng cùng một trong támtuần tuổi (cả hai vắc xin trực tiếp được quản lý trong nước uống). Trong năm 2009, tiêm chủng đầu tiên đã được thực hiệnvắc xin Avipro HB1 với sự căng thẳng HB1 4 tuần tuổi; tiêm chủng thứ hai đã được thực hiện bởi các vắc xinAvipro LaSota với sự căng thẳng LaSota lúc 8 tuần tuổi (cả hai vắc xin trực tiếp được quản lý trong nước uống).Trước khi bắt đầu của thời kỳ đẻ, 14 tuần tuổi, những con gà đã được tái vaccinated bởi các ganvắc xin ND: vắc xin Gallimune 302 ND-IB-EDS, ND căng Ulster 2C trong năm 2007 và 2008;vắc xin Cevac IB-ND-EDS K, ND căng thẳng LaSota đô-la Mỹ trong năm 2009).Trong năm 2008-2010, tổng cộng 280 mẫu máu được lấy từ đẻ thương mại vàthöû nghieäm miễn dịch tiêm phòng sau ND. Trong năm 2008, nhóm của gà mái ở nhà số 4 đã được giám sát tronggiai đoạn đẻ; 20 mẫu máu được thực hiện tại 23, 35, 53 và 71 tuần tuổi, một mẫu 80 tất cả. Trong cáccùng năm, nhóm của gà mái từ nhà số 2, 8 và 10 đã được theo dõi quá; 20 mẫu máu được lấy từmỗi nhà đầu giai đoạn đẻ (khoảng tuổi 20 tuần) và ở phần cuối của việc đặtthời gian (khoảng tuổi 51 tuần). Trong năm 2009, các nhóm của gà mái từ hai ngôi nhà gia cầm (số 4 và 8)theo dõi một lần nữa; 20 mẫu máu được lấy từ mỗi ngôi nhà ở đầu của thời kỳ đẻ và trước khicuối thời kỳ đẻ.Haemagglutination ức chế thử nghiệmKiểm tra sự ức chế (HI) haemagglutination được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của kháng thể chống lạiNDV theo hướng dẫn sử dụng OIE (2010). Công tác phòng thí nghiệm này đã được thực hiện tại nhà nước học viện thú yOlomouc. Newcastle bệnh virus căng thẳng LaSota (ban đầu từ vắc xin Avipest) và NDV antiserum (VLAWeybridge, UK) đã được sử dụng cho HI kiểm tra.Virological thử nghiệmMẫu mô từ 5 con gà mái lựa chọn ngẫu nhiên từ nhà số 4 đã được sử dụng để thử nghiệm virological.Não, khí quản, phổi, gan, thận và caecum với ileocaecal tonsila đã được thực hiện như là các cơ quan bị nghi ngờ. Nămtăm bông mẫu (một trong những mẫu từ các fan hâm mộ trần, một mẫu từ các fan hâm mộ phía sau, một trong những mẫu từ các fan hâm mộ bên vàhai mẫu từ các hộp đựng thức ăn) từ chăn nuôi gia cầm nhà số 4 đã được cũng thực hiện để đảm bảo một hoàn thành virologicalđiều tra.Tách chiết RNA và Reverse transcriptase - phản ứng chuỗi trùng hợp lồng nhau (RT lồng nhau PCR)Tất cả RNA được cô lập bằng cách sử dụng RNeasy Mini Kit (Quiagen, Đức) theo các nhà sản xuấthướng dẫn. F protein gen dãy (n. AY338284) được mua lại từ GenBank (NCBI) đã được sử dụng choRT - lồng nhau phát triển Đảng Cộng sản Romania. Hai bộ của chất mồi dựa trên một khu vực bảo tồn của F protein gen của NDVđược thiết kế. Trình tự của mồi nghĩa là 5´GAA AAA ACA CGG GTA GAA GA 3´, trình tự củamột mồi antisense là 5´GAG CTG AGT TGG TTG TTC C 3´ cho TAC AAC ATA RT-Đảng Cộng sản Romania và 5´GTCACC TCA TCC CAG A 3´ và 5´GCA TTC TGG TTG GCT TGT ATC A 3´ cho Đảng Cộng sản Romania lồng nhau. Một phần củasản phẩm khuếch đại từ lồng nhau PCR (298 bp) là một chuỗi các "trang web cleavage". SYBR 1-BƯỚC QRT-PCRbộ cho một One-Bước RT-PCR (Invitrogen, Hoa Kỳ) đã được sử dụng với một hỗn hợp 20-ml theo các điều kiện sau đây:cách 0.4 ml RT/Taq Mix, 400 mM (mỗi) dNTP và phiên mã ngược 1.6 mM MgCl2. được thực hiện với 3 mlcủa tất cả RNA tại 42 ° C trong 50 phút. Chương trình khuếch đại PCR bao gồm 40 chu kỳ của 94 ° C 35 s,theo sau là 47 ° C cho 35 s và 72 ° C cho 90 s. Cuối cùng, phần mở rộng là ở 72 ° C cho 5 phút PPP Master Mix (TopSinh học, Cộng hoà Séc) được sử dụng cho Đảng Cộng sản Romania lồng nhau. Đảng Cộng sản Romania phản ứng được thực hiện với 1 ml sản phẩm khuếch đạitừ RT-Đảng Cộng sản Romania. Chương trình khuếch đại PCR bao gồm 40 chu kỳ của 94 ° C 35 s, theo sau là 54 ° C cho35 s và 72 ° C cho 60 s. Cuối cùng, phần mở rộng là ở 72 ° C cho 5 phút. Sản phẩm khuếch đại sau khi Đảng Cộng sản Romania lồng nhauphân tích bởi điện trên một agarose 2% gel nhuộm màu với bromua ethidium. Kích thước mảnh (298 bp) làso với các bậc thang DNA (kết hợp bậc thang DNA O'Gene RulerTM, Fermentas, Hoa Kỳ).Xác định trình tự của Đảng Cộng sản Romania sản phẩm và phân tích phát sinh loàiSản phẩm Đảng Cộng sản Romania (298bp)

Kết quả (Việt) 2:

Phát hiện virus bệnh Newcastle và ảnh hưởng của sự phát triển
của sau tiêm phòng miễn dịch trong một đàn thương mại của gà đẻ
Jana Jeřábková1, Růžena Juranová2, Kateřina Rosenbergová3,4, Libuše Kulíková2,
Alfred Hera1, Petr Lány3,4, Oldřich Kubíček4, Josef Koláček5
1Institute cho kiểm tra Nhà nước về chế phẩm sinh học thú y và thuốc, Brno, Cộng hòa Séc
2Avian và Exotic Animal Clinic, 3Department Bệnh truyền nhiễm và dịch tễ học,
Khoa Thú y, Trường Đại học Khoa học thú y và dược phẩm Brno, Cộng hòa Séc
Viện 4National cho hạt nhân, hóa học và sinh học Bảo vệ, Kamenna, Czech Republic
5Company Proagro Nymburk như, bộ phận Opatovice, Cộng hòa Séc
nhận 31 Tháng Ba 2011
Accepted ngày 14 tháng 2 năm 2012
Tóm tắt
Mục tiêu của nghiên cứu này là để theo dõi nồng độ kháng thể chống lại bệnh Newcastle
sau khi tiêm chủng cho gà đẻ ngay từ đầu và cuối cùng của thời kỳ đẻ. Nghiên cứu này
được thực hiện trong một đàn chiên thương mại của gà đẻ trong Opatovice tại Cộng hòa Séc trong
những năm 2008-2010. Tổng cộng có 280 mẫu huyết thanh máu được lấy từ gà đẻ đến
từ bốn ngôi nhà, gia cầm. Các huyết thanh đã được thử nghiệm bằng cách thử nghiệm ức chế ngưng kết hồng cầu theo
sự hướng dẫn dành OIE. Xét nghiệm virus học đã được tiến hành như một hệ quả của kết quả điển hình của các
xét nghiệm huyết thanh học. Newcastle virus bệnh RNA đã được chứng minh bằng phương pháp PCR RT-lồng nhau
trong các mẫu mô gộp của 5 con gà mái, trong các mẫu của ruột với tonsila ileocaecal, trong
khí quản và cũng có trong một mẫu tăm bông từ môi trường của một ngôi nhà. Dựa trên trình tự
phân tích và phân tích phát sinh loài tiếp theo, virus này được xác định là một chủng gây bệnh thấp
của paramyxovirus (PMV-1). Dòng bệnh thấp này không có bất kỳ ảnh hưởng đến sức khỏe của
gà đẻ.
Gia cầm, kháng thể, RT-PCR lồng nhau, sequencing
bệnh Newcastle (ND) là một bệnh do virus rất dễ lây nhiễm của các
loài chim thuộc về loài gà ảnh hưởng đến tất cả các nhóm tuổi, gây ra bởi virus Newcastle bệnh
(NDV) thuộc họ Paramyxoviridae (PMV-1), chi Avulavirus. Viral
gen là không phân đoạn, được hình thành bởi một RNA đơn với cực âm
(-ss RNA), mã hóa cho protein sáu: NP - nucleoprotein, M - protein matrix, F - fusion
protein, HN - haemagglutinin-neuraminidase protein, P - nucleocapsideassociated phosphoryl hóa
protein và L-RNA phụ thuộc RNA polymerase (Kattenbelt et al 2006)..
Các độc lực của NDV liên quan chặt chẽ đến các cleavability biến của protein F
do thành phần axit amin khác biệt của các "vị trí phân cắt" (L ee . et al 2004; de
Leeuw et al 2005).. Nghiên cứu so sánh trình tự axit amin của protein F chứng minh
rằng các chủng đó là độc hại cho gia cầm có 112R / KRQK / RR-F117 axit amin
tự tại "vị trí phân cắt", trong khi các chủng độc lực thấp có 112g / EK / RQ-
G / chuỗi ER-L117 trong lĩnh vực này (Collins et al 1993;. L iu et al 2003.). Kháng nguyên
đa dạng của paramyxoviruses đã được khẳng định ở Úc từ 1998-2000 (Phụ lục
với EFSA Tạp chí 2007).
Bệnh Newcastle có một tác động kinh tế-xã hội lớn (Awan et al 1994;. Alexander
2000; S EAL et al., 2000). Biến đổi đáng kể các triệu chứng lâm sàng, mà phụ thuộc
vào độc lực của các chủng vi rút ND, là điển hình cho bệnh này. Virus Lentogenic
chủng gây chỉ nhẹ hoặc không có triệu chứng lâm sàng, đặc biệt là ở các loài chim trưởng thành,
trong khi các chủng mesogenic gây ra tỷ lệ tử vong cao hơn. Chủng Velogenic gây nặng tiêu hóa, hô hấp và / hoặc các triệu chứng thần kinh và tỷ lệ tử vong đạt đến
gần 100% (B anerjee et al 1994)..
Mặc dù hiệu giá kháng thể, gà bị nhiễm bệnh đào thải virus qua phân; virus sau đó được
truyền transovarially vào trứng và gà bị nhiễm sau đó nở từ đó
trứng (Capua et al. 1993). Việc truyền tải các chủng lentogenic NDV đã chỉ
Pospíšil et al. 1991 người phát hiện virus trực tiếp trong phôi trứng nở và trong
các nội dung đường ruột của gà không tiêm phòng lên đến 25 ngày sau khi nở, mặc dù
thực tế là đàn chiên của cha mẹ đã được tiêm phòng và các kháng thể mẹ truyền cụ thể đã
hiện diện trong con gà. Virus bệnh Newcastle biến mất từ những con gà không có
cảm ứng của sản xuất hoạt động của các kháng thể; những con gà đã phản ứng với việc tiêm phòng
chỉ độ chuẩn rất thấp và biến các kháng thể.
Việc phòng chống chủ yếu dựa vào bảo vệ đàn chiên từ sự xuất hiện và lây lan của
nhiễm trùng vào đàn và trên các tiêm phòng ND cụ thể. Những con gà
được tiêm phòng vắc xin sử dụng trực tiếp thường là 2-3 ×, và xung quanh tuổi 18 tuần họ
được revaccinated với vaccine bất hoạt với mục đích để đảm bảo việc bảo vệ đẻ
gà mái cho đến khi kết thúc giai đoạn đẻ. Các trường hợp thiếu sau tiêm phòng miễn dịch
chống lại ND đã được báo cáo trong năm 2007 và năm 2008 bất chấp những biện pháp được đặt ra.
Điều này dẫn chúng tôi giám sát các kháng thể sau tiêm phòng và các xét nghiệm virus học
của gà đẻ để xác định nguyên nhân cho sự phát triển bất thường của sau tiêm phòng
miễn dịch.
Vật liệu và phương pháp
thu thập mẫu
Việc giám sát của các kháng thể chống lại ND đã được thực hiện trong một đàn thương mại của gà đẻ trong Opatovice
tại Cộng hòa Séc. Có 9 chuồng gà, từ đó có 4 chuồng gà (số 2, 4, 8 và 10) đã được
lựa chọn để theo dõi. Ba loại khác nhau của gà mái lai đẻ được giữ trong những nhà cầm: các loại
Isa Brown trong ngôi nhà số 2 với số lượng 40 800 gà mái và trong ngôi nhà số 4 với các tính của 26 880 gà, các
loại Lohmann nâu Lite tại nhà số 8 với các tính của 42 000 gà mái và màu nâu loại Hisex trong ngôi nhà số
10 với số lượng 62 560 gà mái.
Những con gà đã được tiêm hai lần bởi các vaccine sống chống lại ND trong năm 2007 và 2008. Các tiêm chủng đầu tiên bởi
vaccine Avinew với chủng VG / GA lúc 4 tuần tuổi và tiêm phòng thứ hai của vắc-xin này trong tám
tuần tuổi (cả hai loại vắc-xin được tiêm trực tiếp vào nước uống). Trong năm 2009, việc tiêm chủng đầu tiên được thực hiện bởi
các vaccine Avipro HB1 với HB1 căng thẳng ở 4 tuần tuổi; tiêm phòng thứ hai được thực hiện bởi các vaccine
Avipro LaSota chủng LaSota lúc 8 tuần tuổi (cả hai loại vắc-xin được tiêm trực tiếp vào nước uống).
Trước khi bắt đầu giai đoạn đẻ, lúc 14 tuần tuổi, gà được tái chủng ngừa bởi bất hoạt
vaccine chống lại ND: vaccine Gallimune 302 ND-IB-EDS, ND căng Ulster 2C trong những năm 2007 và 2008;
. vaccine Cevac IB-NĐ-EDS K, ND căng LaSota trong năm 2009)
Trong những năm 2008-2010, tổng số 280 mẫu máu được lấy từ gà đẻ thương mại và
thử nghiệm cho ND sau tiêm phòng miễn dịch. Trong năm 2008, nhóm của gà mái trong ngôi nhà số 4 đã được theo dõi trong
giai đoạn đẻ; 20 mẫu máu được lấy tại 23, 35, 53 và 71 tuần tuổi, tổng cộng 80 mẫu. Trong
cùng năm đó, nhóm của gà mái từ nhà số 2, 8 và 10 đã được theo dõi quá; 20 mẫu máu được lấy từ
mỗi ngôi nhà ở đầu thời kỳ đẻ (khoảng tuổi 20 tuần) và ở phần cuối của sự đặt
thời gian (khoảng tuổi 50 tuần). Trong năm 2009, nhóm của gà mái từ hai nhà cầm (số 4 và 8) đã được
giám sát một lần nữa; 20 mẫu máu được lấy từ mỗi ngôi nhà ở đầu giai đoạn lắp đặt và trước khi
kết thúc giai đoạn đẻ.
ức chế ngưng kết hồng cầu kiểm tra
Các ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) thử nghiệm đã được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của các kháng thể chống lại
NDV theo OIE Manual (2010). Làm việc trong phòng thí nghiệm này được thực hiện tại Nhà nước thú y Viện
Olomouc. Newcastle virus bệnh căng LaSota (ban đầu từ các vaccine Avipest) và kháng huyết thanh NDV (VLA
Weybridge, Anh) đã được sử dụng để thử nghiệm HI.
virus học thử nghiệm
Các mẫu mô từ 5 con gà mái lựa chọn ngẫu nhiên từ ngôi nhà số 4 đã được sử dụng cho các xét nghiệm virus học.
Brain , khí quản, phổi, gan, thận và ruột tịt với tonsila ileocaecal được thực hiện như là các cơ quan bị nghi ngờ. Năm
mẫu tăm bông (một mẫu từ các quạt trần, một mẫu từ các fan hâm mộ phía sau, một mẫu từ các fan hâm mộ bên và
hai mẫu từ ăn) từ nhà cầm số 4 cũng đã được thực hiện để đảm bảo một virus hoàn chỉnh
điều tra.
RNA khai thác và Reverse transcriptase - Nested PCR (RT-PCR lồng)
Tổng số RNA được ly trích bằng RNeasy Mini Kit (Quiagen, Đức) theo của nhà sản xuất
hướng dẫn. Các trình tự gen protein F (n. AY338284) mua lại từ GenBank (NCBI) đã được sử dụng cho
RT-PCR lồng nhau phát triển. Hai bộ mồi dựa trên một khu vực bảo tồn của F gen protein của NDV
được thiết kế. Trình tự của mồi nghĩa là 5'GAA AAA ACA CGG GTA GAA GA 3', trình tự của
một mồi antisense là 5'GAG CTG AGT TGG TTG TTC C 3'cho RT-PCR và 5'GTC AAC ATA TAC
ACC TCA TCC CAG A 3'và 5'GCA TTC TGG TTG GCT TGT ATC A 3'cho các nested PCR. Các phần của
sản phẩm khuếch đại từ nested PCR (298 bp) là một chuỗi của các "vị trí phân cắt". SYBR 1-STEP QRT-PCR
kit cho một bước RT-PCR (Invitrogen, USA) đã được sử dụng với một hỗn hợp 20 ml theo các điều kiện sau đây:
0,4 ml của RT / Taq Mix, 400 mM (mỗi) dNTP và 1.6 mM MgCl2. Phiên mã ngược được thực hiện với 3 ml
tổng RNA ở 42 ° C trong 50 phút. Các chương trình khuếch đại PCR gồm 40 chu kỳ của 94 ° C trong 35 s,
tiếp theo là 47 ° C trong 35 s và 72 ° C trong 90 s. Cuối cùng, phần mở rộng là ở 72 ° C trong 5 phút. PPP Master Mix (Top
Bio, Czech Republic) đã được sử dụng cho các nested PCR. Phản ứng PCR được thực hiện với 1 ml sản phẩm khuếch đại
từ RT-PCR. Các chương trình khuếch đại PCR gồm 40 chu kỳ của 94 ° C trong 35 s, tiếp theo là 54 ° C trong
35 s và 72 ° C trong 60 s. Cuối cùng, phần mở rộng là ở 72 ° C trong 5 phút. Các sản phẩm khuếch đại sau nested PCR được
phân tích bằng điện di trên gel agarose 2% nhuộm với ethidium bromide. Kích thước fragment (298 bp) được
so sánh với các bậc thang DNA (DNA O'Gene RulerTM Ladder Mix, Fermentas, USA).
Sequencing của sản phẩm PCR và phân tích phát sinh loài
Các sản phẩm PCR (298bp) là