blot analyses (data not shown). Is

blot analyses



(data not shown). Isogenic Bt-negative lines were derived for each line through Mendelian segregation. Protein Expression. TIC107 expression was evalu- ated in Þeld-grown, homozygous R4 plants of two Bt lines (19459-55 and 19487-35) and their negative iso- lines planted at three locations (Galena, MD; Leland, MS; and Loxley, AL) during the 2002 growing season. Leaf tissues were collected at V3, R1 (R4 at Galena), and R6 stages of plant growth (Fehr et al. 1971) by picking the center leaßet of the youngest fully ex- panded trifoliate from 10 randomly selected plants within three plots of each Bt line and one plot of each negative isoline. For protein expression analysis, 100 mg of crushed, frozen leaf tissue was combined with
10 ml of extraction buffer (50 mM sodium carbonate/ bicarbonate + 2 mM dithiothreitol, 0.07% Tween 20) in a 15-ml polyethylene tube. Eight 6.35-mm chrome- steel beads (BioSpec Products Inc., Bartlesville, OK) were added to the tubes and vigorously shaken in a Harbil 5G HD case mixer (Fluid Management, Wheel- ing, IL) for 7 min. The extract was separated from the solid phase using a serum Þlter (Fisher, Pittsburgh, PA), and 100 pl of extract was treated with trypsin (Calbiochem, La Jolla, CA) equivalent to 540 USP units/ml and incubated at 37°C for 30 min. The pro- tease activity was stopped with 0.125 pM phenylmeth- ylsulfonyl ßuoride (PMSF) from a stock solution of 50 mM PMSF in 2-propanol. Samples were diluted 1:30 and 1:90 with a Tris-borate buffer (TBA) containing
100 mM Tris base, 100 mM Na2B4O7 * 10H2O, 5 mM MgCl2 * 6H2O, 0.05% Tween 20, HCl to pH 7.8, and, just before use, 0.2% L-ascorbic acid dissolved into solution, before loading on assay plates.
Protein expression was determined by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Crowther 1995). A Cry protein standard, comparable with the Cry1Ac encoded by Bt subsp. kurstaki strain HD-73 expressed and puriÞed from Escherichia coli fermentation, was lyophilized, dissolved in 50 mM sodium bicarbonate (pH 9.6), subjected to trypsiniza- tion as described for sample treatment, and serially diluted in TBA to eight concentrations ranging from 32 to 0.25 ng/ml to generate a standard curve for quan- titation of the expressed TIC107. For ELISA, 96-well MaxiSorp Nuncimmuno plates (NUNC A/S, Roskilde, Denmark) were coated with 200 pl/well monoclonal IgG Ab1 (M19N4A6, from mouse) diluted 1:4,800 in coating buffer (50 mM carbonate/bicarbonate and
150 mM NaCl), incubated overnight at 4°C, washed three times with PBST (0.001 M KH2PO4, 0.01 M Na2HPO4, 0.137 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.07% Tween
20, pH 7.4), blocked with 200 pl/well PBSTO (1X PBST, 0.5% oval albumin) at room temperature (RT) for 2 h, and washed one time with PBST. Plates were loaded with 100 pl/well of sample (three replicates per plate for standard, test samples, and positive con- trols; eight per plate for negative controls [A5547 leaf extracts] and TBA buffer blanks), incubated at RT for
2 h and washed three times with PBST. Plates were loaded with 200 pl/well of HD-73 rabbit polyclonal antibody (SDI, Newark, DE), diluted 1:1,000 with PBSTO, incubated at RT for 1.5 h, and washed three

times with PBST. Bound polyclonal IgG was detected with 200 pl/well of donkey anti-rabbit IgG-horserad- ish peroxidase conjugate (Amersham Biosciences Inc., Piscataway, NJ) diluted 1:3,000 with PBSTO. Plates were washed three times with PBST, and then 100 pl/well TMB peroxidase substrate (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) was added and incubated at RT in the dark for 4 min. Reactions were stopped with phosphoric acid, and absorbance was read at 450 nm in a Spectra Max plate reader by using SOFTmax PRO version 3.0 software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Expression data were sub- jected to analysis of variance (ANOVA) by using JMP software version 5.1.1 (SAS Institute 2004) to deter- mine signiÞcant sources of variability among location, line, and replicate at the 0.05 probability level (P). SigniÞcant differences among means were deter- mined using the TukeyÐKramer test (Kramer 1956) at P = 0.05.

Kết quả (Việt) 1:

blot phân tích (dữ liệu không hiển thị). Isogenic Bt âm dòng đã xuất phát cho mỗi dòng thông qua Mendelian phân biệt. Biểu hiện protein. TIC107 biểu hiện là evalu-ated trong Þeld trưởng thành, màu thực vật R4 của hai dòng Bt (19459-55 và 19487-35) và tiêu cực của iso-dòng trồng tại ba địa điểm (Galena, MD; Leland, MS; và Loxley, AL) trong mùa phát triển năm 2002. Lá mô đã được thu thập tại V3, R1 (R4 tại Galena), và R6 giai đoạn tăng trưởng thực vật (Fehr et al. 1971) bằng cách chọn leaßet Trung tâm của trẻ nhất hoàn toàn ex-panded trifoliate từ 10 nhà máy lựa chọn ngẫu nhiên trong ba lô của mỗi đường Bt và một cốt truyện của mỗi isoline tiêu cực. Cho các phân tích biểu hiện protein, 100 mg của lá nghiền, đông lạnh mô đã được kết hợp với10 ml của khai thác đệm (50 mM natri cacbonat / bicacbonat + 2 mM dithiothreitol, 0,07% giữa 20) trong một ống polyethylene 15 ml. Tám 6.35-mm chrome-thép hạt (BioSpec sản phẩm Inc, Bartlesville, OK) đã được thêm vào các ống và rung động mạnh mẽ trong một Harbil 5G HD trường hợp trộn (quản lý chất lỏng, bánh xe-ing, IL) trong 7 phút. Các chiết xuất đã được tách ra từ giai đoạn rắn bằng cách sử dụng một Þlter huyết thanh (Fisher, Pittsburgh, PA), và 100 pl chiết xuất được điều trị với trypsin (Calbiochem, La Jolla, CA) tương đương với 540 USP đơn vị/ml và ủ tại 37° C cho 30 phút. Các hoạt động chuyên nghiệp-tease dừng lại với 0.125 am phenylmeth-ylsulfonyl ßuoride (PMSF) từ dung dịch cổ phiếu của 50 mM PMSF trong 2-propanol. Mẫu đã là pha loãng 1:30 và 1:90 với một bộ đệm (TBA) có chứa Tris-borat100 mM Tris base, 100 mM Na2B4O7 * 10H2O, 5 mM MgCl2 * 6H2O, 0,05% giữa 20, HCl để pH 7.8, và, chỉ cần trước khi sử dụng, 0,2% L-ascorbic acid giải tán vào giải pháp, trước khi tải về khảo nghiệm tấm.Biểu hiện protein đã được xác định bởi gián tiếp liên kết với enzyme immunosorbent khảo nghiệm (ELISA) (Crowther năm 1995). Một protein khóc tiêu chuẩn, so sánh với Cry1Ac mã hóa theo Bt subsp. kurstaki căng thẳng HD-73 bày tỏ và puriÞed từ Escherichia coli quá trình lên men, sản, hòa tan trong 50 mM natri bicacbonat (pH 9.6), phải chịu sự trypsiniza-tion như mô tả cho mẫu điều trị và serially pha loãng trong TBA đến tám nồng độ khác nhau, từ 32 đến 0,25 ng/ml để tạo ra một đường cong tiêu chuẩn cho quân-titation của TIC107 thể hiện. Cho ELISA, 96-cũng MaxiSorp Nuncimmuno tấm (NUNC A/S, Roskilde, Đan Mạch) đã được bao phủ với 200 pl/cũng monoclonal kháng thể IgG Ab1 (M19N4A6, từ chuột) pha loãng 1:4,800 ở lớp đệm (50 mM cacbonat/bicarbonate và150 mM NaCl), ủ qua đêm tại 4 ° C, rửa ba lần với PBST (0,001 M KH2PO4, 0,01 M Na2HPO4, 0.137 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0,07% Tween20, độ pH 7.4), chặn với 200 pl/cũng PBSTO (1 X PBST, Albumin tạo hình bầu dục 0,5%) ở nhiệt độ phòng (RT) cho 2 h, và rửa một thời gian với PBST. Tấm đã được nạp với 100 pl/tốt của mẫu (ba sao chép một đĩa tiêu chuẩn, mẫu thử nghiệm, và tích cực côn-trols; tám mỗi tấm cho tiêu cực điều khiển [A5547 lá chiết xuất] và trống đệm TBA), ủ tại RT cho2 h và rửa ba lần với PBST. Tấm đã được nạp với 200 pl/tốt của HD-73 thỏ kháng thể polyclonal (SDI, Newark, DE), pha loãng 1:1,000 với PBSTO, ủ tại RT cho 1.5 h, và rửa ba lần với PBST. Ràng buộc polyclonal IgG được phát hiện với 200 pl/tốt của lừa chống thỏ IgG-horserad-ish peroxidase liên hợp (Amersham Biosciences Inc, Piscataway, NJ) pha loãng 1:3,000 với PBSTO. Tấm đã được rửa sạch ba lần với PBST, và sau đó peroxidase 100 TMB pl/tốt nền (Kirkegaard & phòng thí nghiệm Perry, Gaithersburg, MD) được thêm vào và ủ tại RT trong bóng tối cho 4 phút phản ứng đã được ngừng lại với axít phốtphoric, và hấp thu được đọc tại 450 nm trong một người đọc đĩa quang phổ tối bằng cách sử dụng phần mềm phiên bản 3.0 SOFTmax PRO (phân tử thiết bịSunnyvale, CA). Biểu hiện dữ liệu đã là phụ-jected để phân tích các phương sai (ANOVA) bằng cách sử dụng JMP phần mềm phiên bản 5.1.1 (SAS viện năm 2004) để ngăn chặn mỏ signiÞcant nguồn của sự biến đổi giữa các địa điểm, dòng, và replicate độ 0,05 xác suất (P). SigniÞcant sự khác biệt giữa phương tiện đã là ngăn chặn - mỏ bằng cách sử dụng TukeyÐKramer kiểm tra (Kramer 1956) tại P = 0,05.

Kết quả (Việt) 2:

phân tích blot (dữ liệu không hiển thị). Dòng Bt âm Isogenic đã bắt nguồn cho mỗi dòng qua sự phân biệt Mendel. Protein Expression. Biểu TIC107 được evalu- ated trong Þeld trồng, cây R4 đồng hợp tử của hai dòng Bt (19.459-55 và 19487-35) và dòng li tiêu cực của họ trồng tại ba địa điểm (Galena, MD; Leland, MS và Loxley, AL ) trong suốt mùa phát triển năm 2002. Mô lá được thu thập tại V3, R1 (R4 tại Galena), và R6 giai đoạn sinh trưởng của cây (Fehr et al. 1971) bằng cách chọn các leaßet trung tâm của động huy động vốn hoàn toàn có ba lá trong một cuống Thí trẻ nhất từ 10 nhà máy được lựa chọn ngẫu nhiên trong ba lô của mỗi dòng Bt và một cốt truyện của mỗi Isoline tiêu cực. Đối với phân tích biểu hiện protein, 100 mg nghiền nát, mô lá đông lạnh đã được kết hợp với 10 ml dung dịch đệm (50 mM sodium carbonate / bicarbonate + 2 mM dithiothreitol, 0,07% Tween 20) trong một ống polyethylene 15 ml. Tám 6.35-mm hạt thép chrome (BioSpec Products Inc., Bartlesville, OK) đã được thêm vào ống và mạnh mẽ rung động trong một trường hợp trộn Harbil 5G HD (Quản lý chất lỏng, bánh xe này ing, IL) cho 7 phút. Các chiết xuất được tách ra từ các pha rắn sử dụng một Þlter huyết thanh (Fisher, Pittsburgh, PA), và 100 pl của chiết xuất đã được điều trị bằng trypsin (Calbiochem, La Jolla, CA) tương đương với 540 đơn vị USP / ml và ủ ở 37 ° C trong 30 phút. Các hoạt động tease trình đã được ngừng lại với 0,125 PM phenylmeth- ßuoride ylsulfonyl (PMSF) từ một giải pháp chứng khoán của 50 mM PMSF trong 2-propanol. Các mẫu được pha loãng 1:30 và 1:90 với một bộ đệm Tris-borat (TBA) có chứa 100 mM Tris cơ sở, 100 mM Na2B4O7 * 10H2O, 5 mM MgCl2 * 6H2O, 0,05% Tween 20, HCl đến pH 7,8, và, chỉ cần trước khi sử dụng, 0,2% axit L-ascorbic hòa tan vào dung dịch, trước khi tải về tấm khảo nghiệm. biểu hiện protein được xác định bằng cách gián tiếp enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Crowther 1995). Một tiêu chuẩn protein Cry, so sánh với các Cry1Ac mã hóa bởi subsp Bt. kurstaki căng HD-73 thể hiện và puriÞed từ Escherichia coli lên men, được đông khô, hòa tan trong 50 mM sodium bicarbonate (pH 9.6), chịu sự trypsiniza- như mô tả trong điều trị mẫu, và pha loãng trong TBA đến tám nồng độ khác nhau, từ 32 đến 0.25 ng / ml để tạo ra một đường cong chuẩn cho titation QUÂN của TIC107 bày tỏ. Đối với ELISA, 96 giếng tấm MaxiSorp Nuncimmuno (Nunc A / S, Roskilde, Đan Mạch) được phủ với 200 pl / cũng đơn dòng IgG AB1 (M19N4A6, từ chuột) pha loãng 1: 4800 trong đệm lớp phủ (50 mM carbonate / bicarbonate và 150 mM NaCl), ủ qua đêm ở 4 ° C, rửa ba lần với PBST (0,001 M KH2PO4, 0,01 M Na2HPO4, 0,137 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,07% Tween 20, pH 7.4), bị chặn với 200 pl / giếng PBSTO ( 1X PBST, 0,5% albumin hình bầu dục) ở nhiệt độ phòng (RT) cho 2 h, và rửa sạch một lần với PBST. Các đĩa được nạp với 100 pl / giếng của mẫu (ba lần nhắc lại mỗi tấm cho các tiêu chuẩn, mẫu thử nghiệm, và trols con- tích cực; tám mỗi tấm cho các điều khiển âm [chiết xuất từ lá A5547] và khoảng trống TBA đệm), ủ ở RT cho 2 h và rửa ba lần với PBST. Các đĩa được nạp với 200 pl / giếng của HD-73 thỏ đa giá kháng thể (SDI, Newark, DE), pha loãng 1: 1000 với PBSTO, ủ ở RT cho 1,5 h, và rửa ba lần với PBST. Ràng buộc đa giá IgG được phát hiện với 200 pl / tốt của con lừa chống thỏ IgG-horserad- ish peroxidase liên hợp (Amersham Biosciences Inc., Piscataway, NJ) pha loãng 1: 3000 với PBSTO. Các đĩa được rửa ba lần với PBST, và sau đó 100 pl / TMB cũng peroxidase chất nền (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) được thêm vào và ủ ở RT trong bóng tối trong 4 phút. Phản ứng đã bị chặn lại bằng acid phosphoric, và hấp thụ được đọc ở 450 nm trong một đầu đọc đĩa Spectra Max bằng cách sử dụng softmax PRO phiên bản 3.0 phần mềm (thiết bị phân tử, Sunnyvale, CA). Dữ liệu biểu hiện bị tiểu jected để phân tích phương sai (ANOVA) bằng cách sử dụng phiên bản phần mềm JMP 5.1.1 (SAS Institute 2004) để xác định nguồn signiÞcant mỏ của biến đổi giữa các vị trí, đường, và nhân rộng ở mức 0,05 xác suất (P). Sự khác biệt giữa các phương tiện SigniÞcant được ngăn chặn, khai thác sử dụng các bài kiểm tra TukeyÐKramer (Kramer 1956) tại P = 0,05.