Porcine reproductive and respirator

Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is a
new viral disease of swine first observed in the United States in
1987 and in Europe in 1990 (3, 9, 28). PRRS is characterized
by reproductive failure through abortion, stillbirth, and mummified
fetuses; the birth of weak piglets; and severe respiratory
disease in newborn and nursing pigs (7).
PRRS virus is a member of the arteriviruses, a group of
small, enveloped, positive-strand RNA viruses (4, 19, 24). The
virus has a genome of approximately 15 kb containing 8 open
reading frames (ORFs) (19). ORFs 1a and 1b encode the
polymerase, and ORFs 5 to 7 encode the major structural
proteins of the virion (20). Antigenic and subsequent genetic
analyses of PRRS viruses isolated from North America and
Europe have revealed clear differences between viruses originating
on the two continents (5, 8, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 21–23,
27). Although the complete genomic sequence has only been
reported for the Lelystad virus (LV) (19), a European strain,
the existence of two genotypes is evident from the comparison
of sequences of ORFs 2 to 7 of European and North American
PRRS virus strains. These ORFs or their predicted proteins
show sequence homologies of only about 50 to 70%, the exception
being the ORF 6 product, which demonstrates close to
80% homology (8, 11, 14, 15, 17, 18, 21, 22).
Serological evidence suggests that infections with a LV-like
PRRS virus (with the presumed European genotype) have
occurred in at least 10% of the surveyed PRRS-infected swine
farms in the United States (1). Isolation in North America of
PRRS viruses with the European genotype, however, has not
been reported.
In several studies, American and Canadian isolates have
been differentiated from European strains with the use of
monoclonal antibodies in immunoperoxidase and immunofluorescent
assays (5, 12, 23). The ability to differentiate between
the North American and European genotypes of PRRS virus
based on the detection of specific nucleic acid sequences is
desirable, both for identification of the causative agent in
PRRS virus outbreaks and to determine and confirm the ability
of monoclonal antibodies to type PRRS viruses. In this report,
a multiplex PCR assay for differentiation of European and
North American genotypes of PRRS virus is described.
PCR primers were designed on the basis of ORF 1bservation among arteriviruses (19), to be more conserved
within and between the two PRRS virus genotypes than those
of other genes. Initial primers were designed from LV sequences
because of the lack of sequence information for North
American strains of PRRS virus for this region of the genome.
Type-specific and type-common primers for multiplex or
nested multiplex PCR (Table 1) were designed after sequencing
a portion of ORF 1b from two North American strains of
PRRS virus: Minnesota MN-1b (11, 29) and Quebec LHVA-
93-3 (13) isolates. Primers were designed by using Primer Designer
for Windows, Version 2.0 (Scientific and Educational
Software, State Line, Pa.), and synthesized with an Applied
Biosystems 391 DNA synthesizer.
Viral RNA was extracted directly from 100 ml of the supernatants
from virus-infected, MARC-145 cell (10) or porcine
alveolar macrophage cultures by using TRIzol (Canadian Life
Technologies Inc., Burlington, Ontario, Canada) and following
the manufacturer’s protocol with modifications, essentially as
described previously (6). RNA was precipitated in isopropanol
with 20 mg of glycogen, and the RNA pellet was resuspended
in 25 ml of water. Serial 10-fold dilutions of virus in Eagle’s
minimal essential medium (beginning with 105 50% tissue culture
infective doses [TCID50]/100 ml) were used for RNA extraction
to determine the lower limit of detection by PCR. Ten
serum samples (100-ml volumes) from two pigs which had been
inoculated intranasally at 3 weeks of age with 5 3 106 TCID50
of LV or U.S. isolate 89-46448 were also used for RNA extraction
and PCR.
Five microliters of the RNA was mixed with 375 ng of random
hexamers (Promega, Madison, Wis.) in a total volume of
21.5 ml and incubated at 708C for 10 min. A reverse transcription
mixture was added to the RNA-hexamer solution to give
a final volume of 50 ml and final concentrations of 0.4 U of
RNAguard RNase inhibitor (Pharmacia, Baie D’Urfe, Quebec,
Canada) per ml, 0.5 mM each deoxynucleoside triphosphate
(dNTP) (Pharmacia), 50 mM Tris HCl (pH 8.3), 75 mM
KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol, and 10 U of Superscript
II reverse transcriptase (Canadian Life Technologies)
per ml. The combined mixture was incubated at room temperature
for 10 min to promote hexamer annealing, and reverse
transcription was carried out at 378C for 1 h, followed by
reaction inactivation at 948C for 5 min.
A 600-bp portion of ORF 1b of the MN-1b and LHVA-93-3
strains of PRRS virus was amplified for PCR cycle sequencing.
Upstream primer SU (59 CATCCTGGGCACCAACA 39) and

Kết quả (Việt) 1:

Hội chứng sinh sản và hô hấp Porcine (PRRS) là mộtbệnh do virus mới của lợn đầu tiên quan sát thấy ở Hoa Kỳ trongnăm 1987 và ở châu Âu năm 1990 (3, 9, 28). TAI đặc trưngbởi sự thất bại sinh sản thông qua phá thai, dễ, và lábào thai; sự ra đời của heo con yếu; và nghiêm trọng đường hô hấpbệnh ở trẻ sơ sinh và cho con bú lợn (7).PRRS virus là một thành viên của arteriviruses, một nhóm cácnhỏ, enveloped, tích cực-strand RNA virus (4, 19, 24). Cácvirus có một gen có chứa 8 mở khoảng 15 kbđọc khung (ORFs) (19). ORFs 1a và 1b mã hóa cácpolymerase và ORFs 5 đến 7 mã hóa cấu trúc chínhprotein virion (20). Kháng nguyên và sau đó di truyềnphân tích về virus PRRS bị cô lập từ Bắc Mỹ vàEurope đã tiết lộ sự khác biệt rõ ràng giữa các vi-rút có nguồn gốctrên hai châu lục (5, 8, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 21-23,27). mặc dù trình tự gen hoàn thành chỉbáo cáo cho Lelystad virus (LV) (19), một chủng châu Âu,sự tồn tại của hai kiểu gen là hiển nhiên từ sự so sánhtrình tự ORFs 2-7 của châu Âu và Bắc MỹChủng virus PRRS. Các ORFs hoặc protein dự đoán của họHiển thị tương tự chỉ khoảng 50-70%, ngoại lệlà sản phẩm ORF 6, mà thể hiện gần gũi với80% tính tương đồng (8, 11, 14, 15, 17, 18, 21, 22).Serological bằng chứng cho thấy rằng các nhiễm trùng với LV nhưVirus PRRS (với kiểu gen châu Âu coi) cóđã xảy ra trong ít nhất 10% nhiễm TAI lợn khảo sátTrang trại ở Hoa Kỳ (1). Bị cô lập ở Bắc Mỹ củaVirus PRRS với kiểu gen châu Âu, Tuy nhiên, không cóđược báo cáo.Trong một số nghiên cứu, người Mỹ và người Canada chủng cóđược phân biệt với châu Âu giống với việc sử dụngMonoclonal kháng thể trong immunoperoxidase và immunofluorescentthử nghiệm (5, 12, 23). Khả năng phân biệt giữaChâu Âu và Bắc Mỹ kiểu gen của PRRS virusDựa trên những phát hiện của axit nucleic cụ thể trình tự làmong muốn, cả hai để xác định các tác nhân gây bệnh trongBùng phát virus PRRS và để xác định và xác nhận khả năngmonoclonal kháng thể kháng loại virus PRRS. Trong báo cáo này,một khảo nghiệm PCR multiplex cho sự khác biệt của châu Âu vàNorth American kiểu gen của PRRS virus được mô tả.Chất nền, mồi PCR được thiết kế trên cơ sở ORF 1bservation giữa arteriviruses (19), để được bảo tồn hơnbên trong và giữa các kiểu gen virus PRRS hai so với những ngườicác gen khác. Chất nền, mồi ban đầu được thiết kế từ trình tự LVvì thiếu thông tin chuỗi cho namNgười Mỹ các chủng virus PRRS cho khu vực này của bộ gen.Dành riêng cho loại hình và phổ biến loại chất nền, mồi cho multiplex hoặclồng multiplex PCR (bảng 1) được thiết kế sau khi trình tựmột phần của ORF 1b từ hai chủng Bắc MỹPRRS virus: Minnesota MN-1b (11, 29) và LHVA Quebec -93-3 chủng (13). Chất nền, mồi được thiết kế bằng cách sử dụng sơn lót thiết kếĐối với Windows, phiên bản 2.0 (khoa học và giáo dụcPhần mềm, nước đường, PA), và tổng hợp với một ứng dụngTổng hợp Biosystems 391 DNA.Virus RNA được chiết xuất trực tiếp từ 100 ml là supernatantstừ tế bào nhiễm virus, MARC-145 (10) hoặc porcinenền văn hóa phế nang đại thực bào bằng cách sử dụng TRIzol (Canadian LifeTechnologies Inc, Burlington, Ontario, Canada) và sauCác nhà sản xuất giao thức với thay đổi, chủ yếu làMô tả trước đó (6). RNA được kết tủa ở isopropanolvới 20 mg glycogen và RNA pellet resuspendedtrong 25 ml nước. Nối tiếp dilutions 10-fold của vi rút của EagleCác phương tiện cần thiết tối thiểu (bắt đầu với 105 50% mô văn hóalây nhiễm liều [TCID50] / 100 ml) đã được sử dụng cho khai thác RNAđể xác định giới hạn dưới của phát hiện bởi Đảng Cộng sản Romania. Mườihuyết thanh mẫu (100 ml tập) từ hai con lợn đãtiêm chủng intranasally lúc 3 tuần tuổi với 5 3 106 TCID50của LV hoặc Mỹ isolate 89-46448 cũng được sử dụng cho khai thác RNAvà Đảng Cộng sản Romania.Năm microliters của RNA được trộn lẫn với 375 ng của ngẫu nhiênhexamers (Promega, Madison, Wis) trong tổng diện tích21,5 ml và ủ ở 708C trong 10 phút. Phiên mã ngượchỗn hợp được thêm vào để giải RNA-hexamer để cung cấp chomột cuối cùng khối lượng 50 ml và cuối cùng nồng độ 0,4 U củaChất ức chế RNAguard RNase (Pharmacia, Baie D'Urfe, Quebec,Canada) mỗi ml, 0,5 mM deoxynucleoside triphosphate(dNTP) (Pharmacia), 50 mM Tris HCl (pH 8.3), 75 mMKCl, 3 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol và 10 U của SuperscriptII ngược (Canada cuộc sống công nghệ)mỗi ml. Hỗn hợp kết hợp được ủ ở nhiệt độ phòngcho 10 phút để thúc đẩy hexamer ủ, và ngược lạiPhiên mã được thực hiện tại 378C trong 1 h, sau đó làphản ứng ngưng hoạt động tại 948C trong 5 phút.Một phần 600-bp của ORF 1b MN-1b và LHVA-93-3trong số các chủng PRRS virus được khuếch đại cho chu kỳ PCR trình tự.Ngược dòng mồi SU (59 CATCCTGGGCACCAACA 39) và

Kết quả (Việt) 2:

Hội chứng sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) là một
bệnh do virus mới của lợn đầu tiên quan sát thấy tại Hoa Kỳ vào
năm 1987 và tại châu Âu vào năm 1990 (3, 9, 28). PRRS được đặc trưng
bởi sự thất bại sinh sản thông qua việc phá thai, thai chết lưu, và xác ướp
bào thai; sự ra đời của heo con yếu; và hô hấp nặng
ở lợn sơ sinh và cho con bú (7).
PRRS virus là một thành viên của arteriviruses, một nhóm
, bao bọc, virus RNA dương sợi nhỏ (4, 19, 24). Các
virus này có một bộ gen của khoảng 15 kb chứa 8 mở
khung đọc (ORFs) (19). ORFs 1a và 1b encode
polymerase, và ORFs 5-7 mã hóa các cấu trúc lớn
protein của virion (20).
Gen kháng nguyên và tiếp theo phân tích của virus PRRS phân lập từ Bắc Mỹ và
châu Âu đã tiết lộ sự khác biệt rõ ràng giữa các virus có nguồn gốc
trên hai châu lục (5, 8, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 21-23,
27). Mặc dù trình tự bộ gen hoàn chỉnh chỉ được
báo cáo cho virus Lelystad (LV) (19), một chủng châu Âu,
sự tồn tại của hai kiểu gen là hiển nhiên từ so sánh
trình tự của ORFs 2-7 của châu Âu và Bắc Mỹ
chủng virus PRRS. Những ORFs hoặc protein dự đoán của họ
cho thấy tính tương đồng trình tự chỉ khoảng 50-70%, ngoại lệ
là các sản phẩm ORF 6, trong đó chứng tỏ gần
80% tương đồng (8, 11, 14, 15, 17, 18, 21, 22).
Bằng chứng huyết thanh học cho thấy rằng nhiễm trùng với một LV giống như
vi rút PRRS (với kiểu gen châu Âu coi) đã
xảy ra trong ít nhất 10% số lợn tai xanh nhiễm khảo sát
các trang trại ở Hoa Kỳ (1). Phân lập ở Bắc Mỹ của
virus với các kiểu gen châu Âu PRRS, tuy nhiên, đã không
được báo cáo.
Trong một số nghiên cứu, phân lập của Mỹ và Canada đã
được phân biệt chủng châu Âu với việc sử dụng các
kháng thể đơn dòng trong immunoperoxidase và miễn dịch huỳnh quang
nghiệm (5, 12, 23). Khả năng phân biệt giữa
các kiểu gen ở Bắc Mỹ và châu Âu của virus PRRS
dựa trên việc phát hiện các trình tự axit nucleic cụ thể là
mong muốn,
cả hai để xác định các tác nhân gây bệnh trong đợt bùng phát virus PRRS và để xác định và khẳng định khả năng
của các kháng thể đơn dòng để gõ virus PRRS. Trong báo cáo này,
một xét nghiệm PCR multiplex cho sự khác biệt của châu Âu và
kiểu gen Bắc Mỹ của virus PRRS được mô tả.
Mồi PCR được thiết kế trên cơ sở ORF 1bservation trong arteriviruses (19), được bảo tồn nhiều hơn
trong và giữa các kiểu gen hai PRRS rút hơn những người
của các gen khác. Mồi ban đầu được thiết kế với những chuỗi LV
vì thiếu thông tin chuỗi Bắc
chủng Mỹ của virus PRRS cho khu vực này của bộ gen.
Type-cụ thể và loại phổ biến mồi cho multiplex hoặc
lồng multiplex PCR (Bảng 1) được thiết kế sau khi giải trình tự
một phần của ORF 1b từ hai chủng Bắc Mỹ của
virus PRRS: Minnesota MN-1b (11, 29) và Quebec LHVA-
93 -3 (13) chủng. Mồi được thiết kế bằng cách sử dụng Primer thiết kế
cho Windows, phiên bản 2.0 (Khoa học và Giáo dục
Phần mềm, State Line, Pa.), Và tổng hợp với một ứng dụng
Biosystems tổng hợp 391 DNA.
Viral RNA đã được chiết xuất trực tiếp từ 100 ml nước nổi
từ nhiễm virus, MARC-145 tế bào (10) hoặc lợn
nền văn hóa đại thực bào phế nang bằng cách sử dụng TRIzol (Canada Cuộc sống
Technologies Inc., Burlington, Ontario,
Canada) và sau giao thức của nhà sản xuất với những thay đổi, về cơ bản như
mô tả trước đây (6). RNA đã bị kết tủa trong dung môi isopropanol
với 20 mg glycogen, và các viên RNA được lơ lửng
trong 25 ml nước. Nối tiếp pha loãng 10 lần của virus trong Eagle của
phương tiện cơ bản tối thiểu (bắt đầu với 105 50% nuôi cấy mô
liều nhiễm [TCID50] / 100 ml) được sử dụng để chiết xuất RNA
để xác định giới hạn dưới của phát hiện bằng PCR. Mười
mẫu huyết thanh (100 ml khối lượng) từ hai con lợn đó đã được
tiêm đường mũi lúc 3 tuần tuổi với 5 3 106 TCID50
của LV hay Mỹ cô lập 89-46.448 cũng được sử dụng để chiết xuất RNA
và PCR.
Năm microliters của RNA được trộn với 375 ng ngẫu nhiên
hexamers (Promega, Madison, Wis.) Trong tổng khối lượng
21,5 ml và ủ ở 708C trong 10 phút. Một phiên mã ngược
hỗn hợp đã được thêm vào dung dịch RNA-hexame để cung cấp cho
một khối lượng cuối cùng của 50 ml và nồng độ cuối cùng của 0,4 U của
RNAguard chất ức chế RNase (Pharmacia, Baie D'Urfe, Quebec,
Canada) mỗi ml, 0,5 mM mỗi triphosphate deoxynucleoside
(dNTP sẽ) (Pharmacia), 50 mM Tris HCl (pH 8.3), 75 mM
KCl, 3 mM MgCl 2, 10 mM dithiothreitol, và 10 U Nằm ở trên
II đảo ngược transcriptase (Canada Life Technologies)
mỗi ml. Hỗn hợp kết hợp được ủ ở nhiệt độ phòng
trong 10 phút để thúc đẩy hexame ủ,
và ngược lại phiên mã đã được thực hiện ở 378C trong 1 giờ, tiếp theo là
phản ứng bất hoạt ở 948C trong 5 phút.
Một phần 600-bp của ORF 1b của MN-1b và LHVA-93-3
chủng virus PRRS được khuếch đại PCR cho chu trình tự.
Upstream mồi SU (59 CATCCTGGGCACCAACA 39) và

Kết quả (Việt) 3:

Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) là một loàiMỹ đã lần đầu tiên phát hiện ra con lợn bệnh virus mới.Năm 1987, và ở châu Âu 1990 (3, 9, 28).Porcine reproductive and respiratory syndrome is characterized byBy sản thất bại. Phá thai, thai chết lưu và xác ướp.Bào thai, thai sinh ra hơi thở yếu; nghiêm trọng.Trẻ sơ sinh, bệnh tật, và cho con bú lợn con (7).Porcine reproductive and respiratory syndrome virus viêm động mạch là thành viên của một nhómNhỏ, bao bọc, dương sợi RNA virus (4, 19, 24).Cái nàyBộ gen của virus trong khoảng 15 KB mở chứa 8.Khung đọc (ORF) (19).ORF 1A và 1b mã hóaPolymerase và ORF 5 mã hóa cấu trúc chính 7Virus protein (20).Và sau đó Antigenic di truyềnPorcine reproductive and respiratory syndrome virus Bắc Mỹ được tách ra và phân tích.Châu Âu đã bộc lộ rõ ràng giữa virus khác nhau.Ở hai châu lục (5, 8, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 23),27).Mặc dù chỉ có toàn bộ genome sequenceBáo cáo Lelystad virus (LV) (19), một sự căng thẳng của châu Âu,Hai kiểu gen tồn tại là rõ ràng hơn.2 trình ORF 7 của châu Âu và Bắc Mỹ.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus chủng.Những dự đoán của gen hay proteinCho thấy chỉ có khoảng 50 đến trình tự tương đồng của anh khỏe, ngoại lệ.Ở ORF 6 sản phẩm, điều đó cho thấy gần80% tương đồng (8, 11, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22). bằng chứng, nhiễm trùng với LV.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (theo giả thuyết châu Âu có loại)Ít nhất 5% bị điều tra PRRS nhiễm trùng lợn xuất hiệnNông trại của Mỹ (1).Bắc Mỹ cách ly.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus loại với châu Âu, tuy nhiên, không cóBáo cáo.Trong một số nghiên cứu đã bị cách ly trong, Mỹ và Canada.Căng thẳng và sử dụng từ châu Âu.MAB trong nhóm hóa miễn dịch và miễn dịch huỳnh quangPhân tích (5, 12, 23).Khả năng phân biệtỞ Bắc Mỹ và châu Âu - Porcine reproductive and respiratory syndrome virusCụ thể là dựa trên trình tự ADN đã phát hiệnĐáng khen, đã được dùng để xác định các tác nhân gây bệnhPorcine reproductive and respiratory syndrome virus có khả năng bùng nổ và xác định và xác nhậnPorcine reproductive and respiratory syndrome virus MAB type.Trong bản báo cáo,Châu Âu và châu Âu phát hiện đa phương pháp PCRGiới thiệu của North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus gen.Virus viêm động mạch ORF 1bservation mồi PCR trong nền tảng thiết kế (19), hơn là bảo thủ.Với hai kiểu gen của virus PRRS giữa hơnGen khác.Mồi ban đầu thiết kế chuỗi thất trái.Trình tự do thiếu thông tinBộ gen này của khu vực Mỹ chủng porcine reproductive and respiratory syndrome virus.Cụ thể loại và kiểu loại mồi bình thường. đa PCR (bảng 1) sequencing sau thiết kế.Từ hai chủng ORF 1B phần ở Bắc Mỹ.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus: Minnesota mn-1b (11, 29) và Quebec lhva...93-3 (13) chủng.Thiết kế thiết kế mồi dùng mồiĐối với Windows, phiên bản 2 (khoa học và giáo dục.Tình trạng hàng phần mềm.), và một dùng để tổng hợp391 hệ sinh học tổng hợp DNA.Là trực tiếp từ 100 ml được chiết xuất của Các gạn virus RNATừ các tế bào nhiễm virus Marc-145, (10) hay lợnĐại thực bào phế nang Trizol (huấn luyện sử dụng cuộc sống của Canada.Technical Ltd., Burlington, Ontario, Canada),Nhà sản xuất có thỏa thuận với các thay đổi cơ bảnĐã từng mô tả (6).Isopropanol kết tủa RNACùng với glycogen 20 mg, và RNA hạt lơ lửngTrong 25 ml nước.Con đại bàng của virus series gấp 10 lần so với dung dịch pha loãngTối thiểu phải medium (- 50 tổ chức huấn luyện bắt đầu) (105.Liều nhiễm [TCID50] / 100 ml) dùng để chiết xuất RNA- Khuếch đại gen xác định giới hạn.10.Hai con lợn mẫu huyết thanh (100 ml volume)Mũi tiêm chủng trong 3 tuần trong vòng 3 với 5 TCID50 106 tuổiLV hay Mỹ 89-46448 cũng dùng để chiết tách RNAVà PCR.Năm 375 Nack hỗn hợp ngẫu nhiên của RNA6 (Công ty Promega, Madison, Wisconsin) trong tổng khối lượng21.5 ml, trong 10 phút, đảo lục 708c nởTrộn thêm vào dung dịch cho cơ thể lục tụ RNACuối cùng là 50 ml nồng độ khối lượng và cuối cùng cho 0.4 UCác chất ức chế RNAguard RNase (Pharmacia, hạc bay! D'urfe, Quebec,Canada) mỗi ml, 0.5 mm Deoxynucleoside triphosphate(dNTP) (Pharmacia), 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mmClorua kali, magiê clorua 3 mm và 10 mm DTT, và superscript U 10Phiên mã ngược (Canada, công nghệ mạng)Ml hỗn hợp ở nhiệt độ phòng dưới nở10 phút nữa, đẩy Sáu ủ, và chốngPhiên mã ở 1 tiếng 378c tiến hành, và thứ hai là5 phút, trong phản ứng 948c hoạtMột phần của ORF 600 ca 1B mn-1b và lhva-93-3Porcine reproductive and respiratory syndrome virus chủng khuếch đại PCR lưu sequencing.Thượng nguồn tư liệu * Núi Su - in (59 catcctgggcaccaaca 39) và