Materials and methodsBacterial stra

Materials and methods
Bacterial strains, plasmids, and culture conditions
Pyrococcus furiosus (DSM 3638) was obtained from the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ). Cells were grown anaerobically at 97 o C in DSMZ medium 377, and the extracted total DNA (extraction described below) was used as template for PCR. The E. coli strain DH5a (Cwbio, China) was used for plasmid propagation. The E. coli strain BL21(DE3) pLysS
(Cwbio, China) was used for the expression of His6-tagged Pfu DNA polymerase. The plasmid pET-30a (Novagen, UK) was used for constructing the recombinant vector, and the plasmid pACYC184 (Fermentas, Canada) was used as the template for assaying Pfu activity. Both of the E. coli strains were cultured at 37 C and 200 rpm in LB medium, and then the corresponding antibiotic was added. The LB medium was composed of (g L-1) 10 peptone, 5 yeast extract, and 10 NaCl.
Construction of expression system
DNA was isolated using a Genomic DNA Kit (TransGen, China). The specific primers were designed for amplification and recombination based on the Pfu DNA polymerase sequence (GenBank Accession No. D12983) and the plasmid pET-30a restriction sites. The Pfu DNA polymerase gene flanked by NcoI and SalI sites was amplified by PCR using the following two primers [sense [50-CATGCCATGGCAATGATTTTAGATGTGGATTA-30] and antisense[50- GCGCGTCGACCTAGGATTTTTTAATGTTAAGC-30]]; the underlined sequences indicate the NcoI site and SalI sites, respectively. The PCR reaction was conducted using Pfu DNA polymerase (Cwbio, China). The PCR product of the mature Pfu gene and the plasmid pET- 30a were digested with NcoI and SalI restriction enzymes, respectively (NEB, USA). The fragments were purified using a PCR Purification Kit (TransGen, China), and were
then ligated with T4 DNA ligase into the pET30-Pfu plasmid. The pET30-Pfu plasmid was propagated in E. coli DH5a, isolated using the Plasmid MiniPrep Kit (TransGen, China), and then sequenced to ensure sequence integrity. The pET30-Pfu plasmid was transformed into E. coli BL21(DE3) pLysS, and the recombinant strain was grown overnight at 37 o C at 200 rpm in LB containing 35 lg mL-1 kanamycin and 50 lg mL-1 chloramphenicol, and then aliquots containing glycerol were collected and stored at -80 C.

Kết quả (Việt) 2:

Vật liệu và phương pháp
chủng, plasmid, và điều kiện nuôi cấy vi khuẩn
Pyrococcus furiosus (DSM 3638) đã thu được từ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ). Các tế bào được nuôi cấy kỵ khí ở 97 o C trong DSMZ trung 377, và tổng số DNA chiết xuất (khai thác được mô tả bên dưới) được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Các E. coli chủng DH5a (Cwbio, Trung Quốc) đã được sử dụng cho công tác tuyên truyền plasmid. Các chủng E. coli BL21 (DE3) pLysS
(Cwbio, Trung Quốc) đã được sử dụng cho các biểu hiện của His6-tagged PFU DNA polymerase. Các plasmid pET-30a (Novagen, Vương quốc Anh) đã được sử dụng để xây dựng các vector tái tổ hợp, và các plasmid pACYC184 (Fermentas, Canada) đã được sử dụng như một khuôn mẫu cho khảo nghiệm hoạt động PFU. Cả hai của các chủng E. coli được nuôi cấy ở 37 C và 200 rpm trong LB trung bình, và sau đó các kháng sinh tương ứng đã được bổ sung. Các trung LB đã bao gồm (g L-1) 10 peptone, 5 chiết xuất nấm men, và 10 NaCl.
Xây dựng các hệ thống biểu hiện
DNA được ly trích bằng một DNA Kit Genomic (TransGen, Trung Quốc). Các cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để khuếch đại và tái tổ hợp dựa trên các chuỗi polymerase DNA PFU (GenBank nhập số D12983) và các trang web hạn chế plasmid pET-30a. Các gene polymerase DNA PFU hai bên NcoI và Sali trang web đã được khuếch đại bằng PCR sử dụng hai cặp mồi sau [ý nghĩa [50-CATGCCATGGCAATGATTTTAGATGTGGATTA-30] và antisense [50 GCGCGTCGACCTAGGATTTTTTAATGTTAAGC-30]]; các trình tự được gạch chân chỉ ra NcoI trang web và các trang web Sali, tương ứng. Phản ứng PCR được thực hiện bằng cách sử dụng PFU DNA polymerase (Cwbio, Trung Quốc). Các sản phẩm PCR của gen PFU trưởng thành và các plasmid PET-30a được tiêu hóa với NcoI và Sali enzim giới hạn, tương ứng (NEB, USA). Các mảnh vỡ đã được tinh chế bằng phương pháp PCR Purification Kit (TransGen, Trung Quốc), và đã được
sau đó ligated với T4 DNA ligase vào plasmid pET30-PFU. Các pET30-PFU plasmid được truyền bá trong E. coli DH5a, cô lập bằng cách sử dụng Plasmid MiniPrep Kit (TransGen, Trung Quốc), và sau đó trình tự để đảm bảo tính toàn vẹn chuỗi. Các pET30-PFU plasmid đã được chuyển đổi thành E. coli BL21 (DE3) pLysS, và chủng tái tổ hợp đã được phát triển qua đêm ở 37 o C ở 200 rpm trong LB chứa 35 lg mL-1 kanamycin và 50 lg mL-1 chloramphenicol, và sau đó dung dòch chứa glycerol được thu thập và lưu trữ ở -80 C.