HSV-1 quiescency modelThe HSV-2 qui

HSV-1 quiescency model
The HSV-2 quiescency model from Russell et al. [47, 48] was adapted for HSV-1 in MRC5 cells. In short, MRC5-Cas9 cells were seeded in multiple 6-wells plates 3 days prior infection at 210.000 cells/well. After 3 days, the cells were infected with 105k viral HSV-1-eGFP particles/well at 37°C for one hour. The infected MRC5-Cas9 cells were subsequently washed twice with complete medium and incubated in a CO2 incubator at 42°C for 4 days. The culture medium was replaced every day. After 4 days, the cells were returned to regular cell culture conditions (37°C 5% CO2). Next, cells were monitored by fluorescence microscopy for 6 days to exclude wells displaying signs of spontaneously reactivation, which occurred in ± half of the wells. Cells were subsequently harvested and plated at 150,000 cells/well in 12-wells plates. The next day, wells not displaying signs of spontaneous reactivation were transduced with gRNA-carrying lentivirus and selected for after 3 days using puromycin (2μg/ml) for the duration of 3 days. MRC5-Cas9 cells containing quiescent HSV-1-eGFP were counted and 40,000 cells/well (48-well plate) were seeded in triplicate in 48 well plates. The remainder was pelleted and subjected to gDNA isolation using the Quick-gDNA Miniprep kit (Zymo Research, USA). The gDNA was subjected to qPCR to determine the relative HSV-1 genome content. Quiescent MRC5-Cas9 cells were infected the next day with AD169 HCMV (ATCC VR538) to trigger HSV-1-eGFP reactivation. Three days later, cells were harvested, fixed with formaldehyde (1%), and measured by flow cytometry to assess the percentage of eGFP-positive cells as a measure for cells with replicating HSV-1-eGFP.

Kết quả (Việt) 1:

HSV-1 mô hình quiescencyHSV-2 quiescency mô hình từ Russell et al. [47, 48] đã thích nghi với HSV-1 trong các tế bào MRC5. Trong ngắn hạn, tế bào MRC5-Cas9 đã hạt trong nhiều 6 wells tấm 3 ngày trước khi nhiễm trùng tế bào 210.000/tốt. Sau 3 ngày, các tế bào bị nhiễm 105 k virus HSV-1-eGFP hạt/tốt ở 37° C trong một giờ. Các tế bào MRC5-Cas9 bị nhiễm bệnh sau đó rửa sạch hai lần với đầy đủ phương tiện và ủ trong một vườn ươm CO2 tại 42° C trong 4 ngày. Văn hóa vừa được thay thế mỗi ngày. Sau 4 ngày, các tế bào đã quay trở lại điều kiện văn hóa thường xuyên di động (37° C 5% CO2). Tiếp theo, các tế bào đã được giám sát bởi các kính hiển vi huỳnh quang cho 6 ngày để loại trừ các giếng Hiển thị các dấu hiệu kích hoạt một cách tự nhiên, diễn ra tại ± một nửa các giếng. Các tế bào sau đó đã được thu hoạch và mạ lúc 150.000 tế bào/tốt trong 12-wells tấm. Ngày hôm sau, giếng không hiển thị dấu hiệu tự phát kích hoạt đã được transduced với lentivirus gRNA thực hiện và lựa chọn cho sau 3 ngày bằng cách sử dụng puromycin (2μg/ml) trong suốt thời gian 3 ngày. MRC5-Cas9 các tế bào có chứa quiescent HSV-1-eGFP đã được tính và 40.000 tế bào/tốt (48-cũng tấm) hạt trong triplicate trong 48 cũng tấm. Phần còn lại là pelleted và phải chịu sự cô lập gDNA bằng cách sử dụng bộ công cụ Quick-gDNA Miniprep (nghiên cứu Zymo, USA). GDNA đã phải chịu để qPCR để xác định nội dung tương đối gen HSV-1. Quiescent MRC5-Cas9 tế bào bị nhiễm ngày hôm sau với AD169 HCMV (ATCC VR538) để kích hoạt kích hoạt HSV-1-eGFP. Ba ngày sau đó, các tế bào đã được thu hoạch, cố định với formaldehyde (1%) và đo bằng dòng chảy cytometry để đánh giá tỷ lệ tích cực eGFP tế bào như là một biện pháp cho các tế bào với sao chép HSV-1-eGFP.

Kết quả (Việt) 2:

HSV-1 yên tỉnh mô hình
Các HSV-2 yên tỉnh mô hình từ Russell et al. [47, 48] đã được chuyển cho HSV-1 trong MRC5 tế bào. Tóm lại, các tế bào MRC5-Cas9 đã gieo nhiều 6 giếng tấm nhiễm trước 3 ngày tại 210.000 tế bào / giếng. Sau 3 ngày, các tế bào bị nhiễm virus 105k hạt HSV-1-EGFP / giếng ở 37 ° C trong một giờ. Các tế bào MRC5-Cas9 nhiễm sau đó được rửa sạch hai lần với môi trường hoàn và ủ trong tủ ấm CO2 ở 42 ° C trong 4 ngày. Các môi trường nuôi cấy đã được thay thế mỗi ngày. Sau 4 ngày, các tế bào được trở lại điều kiện nuôi cấy tế bào thông thường (37 ° C 5% CO2). Tiếp theo, các tế bào đã được giám sát bằng kính hiển vi huỳnh quang trong 6 ngày để loại trừ các giếng có những biểu hiện tự kích hoạt, xảy ra trong nửa ± giếng. Các tế bào sau đó được thu hoạch và mạ 150.000 tế bào / trong 12 giếng tấm. Ngày hôm sau, giếng không có những biểu hiện kích hoạt tự phát đã được tải nạp với gRNA mang lentivirus và chọn để sau 3 ngày sử dụng puromycin (2μg / ml) trong thời gian 3 ngày. Tế bào MRC5-Cas9 chứa tĩnh HSV-1-EGFP được đếm và 40.000 tế bào / (48-cũng tấm) đã được gieo trong ba lần trong 48 giếng. Phần còn lại được ăn viên và phải chịu gDNA cô lập bằng cách sử dụng Miniprep nhanh gDNA kit (Zymo Research, Mỹ). Các gDNA đã chịu qPCR để xác định tương đối HSV-1 nội dung bộ gen. Các tế bào hoạt động gì MRC5-Cas9 đã bị nhiễm bệnh vào ngày hôm sau với AD169 HCMV (ATCC VR538) để kích hoạt HSV-1-EGFP kích hoạt lại. Ba ngày sau đó, các tế bào được thu hoạch, cố định với formaldehyde (1%), và đo bằng dòng cytometry để đánh giá tỷ lệ phần trăm của các tế bào EGFP dương như một biện pháp cho các tế bào với sao chép HSV-1-EGFP.