. MaterialsThe reagent grade chemic

. Materials
The reagent grade chemicals potato dextrose agar, Czepak Dox agar, Starch, Yeast extract, H2PO4,
Na2HPO4, MgSO4, CaCl2, FeSO4, MnSO4, ZnSO4, CuSO4 were procured from Hi-Media, Mumbai. Guiacol, ABTS
and CBB G-250 were purchased commercially from SIGMA, USA and used for analytical purpose.
2.2. Isolation of the fungal strain
The fungus used in this study was isolated from natural habitat such as decaying tamarind wood in the
vicinity of Kodaikanal, Tamil nadu, India. The selected strain was identified at the School of Basic Medical Science,
Taramani, Chennai as Ganoderma sp. The culture was periodically subcultured and maintained on potato dextrose
agar plates grown at 270
C and stored at 40
C.
2.3. Screening of fungi for laccase production
The isolated fungal cultures were screened for lignolytic enzyme laccase, on Czapek-Dox agar11. The
substrate ABTS (1mM) was amended with the basal medium in order to screen the presence of laccase. Plates
containing lignolytic enzyme substrates were inoculated with a mycelial disk and incubated at 270
C for five days.
Oxidation zone around the mycelial colony indicates the presence of lignolytic enzymes.
2.4. Production of Laccase
Five agar disk taken from the active borders of PDA cultures were transferred to Erlenmeyer flasks (250
mL) containing 100 mL of the following liquid medium (in g.L-1): starch (20), yeast extract (2.5), H2PO4 (1.0),
Na2HPO4 (0.05), MgSO4 (0.5), CaCl2 (0.01), FeSO4 (0.01), MnSO4 (0.001), ZnSO4 (0.001), CuSO4 (0.002). The pH
of the medium was adjusted to 5.5. After 14 days of incubation laccase activity and protein concentration were
determined12.
2.5. Analytical methods
2.5.1. Extracellular laccase activity
Extracellular laccase activity was measured spectrophotometrically13 with ABTS as substrate. The reaction
mixture contains 900 µl of 1 mM ABTS in 0.1 M sodium acetate buffer (pH 5.0) and 0.1 ml of enzyme. The reaction
was monitored by measuring the change in A436 (€ = 2.9×104
cm−1
M−1
) for 3 minutes. One unit enzyme activity was
defined as the amount of enzyme that oxidizes 1  mole of ABTS per minute at 270
C. The activities were expressed
in U/ml.
ISSN: 0975-5462 7134
R.Sivakumar et al. / International Journal of Engineering Science and Technology
Vol. 2(12), 2010, 7133-7141
2.5.2. Estimation of protein
The protein conncetration was determined14 using the Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad) and using
bovine serum albumin (BSA) as standard.
2.6. Optimization of culture conditions for laccase production by Ganoderma sp.
The production medium was optimized for the following parameters for a period of 14 days. For each
experiment five mycelial discs (6mm diameter) were used as inoculum in 100 mL medium.
2.6.1. Time course study
In order to find the optimal time of incubation for the maximum laccase production 100ml production
medium was prepared in Erlenmeyer flask (250 ml) and autoclaved. To these five discs (6mm in diameter) of 5 day
old culture was inoculated and incubated at 270
C for a period of 14 days. The culture was harvested at every 2 day
interval. This was used to determine protein content and enzyme activity.
2.6.2. Effect of pH on laccase production
The effect of pH on laccase production was carried out by incubating the culture flasks containing 100 ml
of production medium inoculated with five mycelial discs (6 mm) at different pH such as 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, and 6.5.
These experiments were conducted for a period of 14 days.
2.6.3. Effect of carbon sources on laccase production
The effect of different carbon sources like manitol, lactose, maltose, glucose, and sucrose on the production
of laccase from Ganoderma sp was studied. The carbon sources were amended at the concentration of 2% in the
production medium. The five mycelial discs (6 mm diameter) of 5-day-old culture were transferred to Erlenmeyer
flasks (250 ml) containing 100 ml of production medium. Flasks were incubated at 270
C for a period of 14 days.
2.6.4. Effect of nitrogen sources on laccase production
In order to find the suitable nitrogen source for the maximum production of laccase by Ganoderma sp the
following organic and inorganic nitrogen sources namely sodium nitrate, peptone, beef extract, ammonium sulphate,
and ammonium chloride were amended at the concentrations 0.2%. The five mycelial discs (6 mm diameter) of 5-
day-old culture were transferred to Erlenmeyer flasks (250 ml) containing 100 ml of production medium. Flasks
were incubated at 270
C for a period of 14 days.
2.6.5. Effect of solvent on laccase production
The effects of different solvents like ethanol, methanol, propanol, iso propanol and 2-methyl 1-propanol on
the production of laccase from Ganoderma sp was studied. The sources were amended at the concentration of 4% in
the production medium. The mycelial discs (6mm diameter) of 5-day-old culture were transferred to Erlenmeyer
flasks (250ml) containing 100 ml of production medium. Flasks were incubated at 270
C for a period

Kết quả (Việt) 1:

. Vật liệuChất thử hóa chất lớp khoai tây dextrose agar, Czepak Dox agar, tinh bột, men chiết xuất, H2PO4,Na2HPO4, MgSO4, CaCl2, FeSO4, MnSO4, ZnSO4, CuSO4 đã mua từ Hi-phương tiện truyền thông, Mumbai. Guiacol, ABTSvà CBB G-250 đã mua thương mại từ SIGMA, Hoa Kỳ và được sử dụng cho mục đích phân tích.2.2. sự cô lập của các chủng nấmCác loại nấm được sử dụng trong nghiên cứu này được cô lập từ môi trường sống tự nhiên như mục nát tamarind gỗ trong cácvùng lân cận của Kodaikanal, Tamil nadu, Ấn Độ. Sự căng thẳng đã chọn đã được xác định tại các trường học của y khoa khoa học cơ bản,Taramani, Chennai như linh chi sp. Các nền văn hóa theo định kỳ subcultured và duy trì trên khoai tây dextroseAgar tấm phát triển tại 270C và được lưu trữ tại 40C.2.3. kiểm tra nấm laccase sản xuấtCác nền văn hóa bị cô lập của nấm được chiếu cho lignolytic enzyme laccase, trên Czapek-Dox agar11. Cácbề mặt ABTS (1mM) được sửa đổi với các phương tiện cơ sở để màn hình sự hiện diện của laccase. Tấmlignolytic có chứa men tiêu hóa chất đã tiêm chủng với một đĩa mycelial và ủ tại 270C cho 5 ngày.Quá trình oxy hóa khu vực xung quanh thuộc địa mycelial chỉ ra sự hiện diện của các enzym lignolytic.2.4. sản xuất Laccase5 đĩa agar chụp từ biên PDA nền văn hóa, hoạt động được chuyển đến Erlenmeyer bình (250mL) có chứa 100 mL của các vật chứa chất lỏng sau (trong g.L-1): tinh bột (20), chiết xuất nấm men (2.5), H2PO4 (1.0),Na2HPO4 (0,05), MgSO4 (0.5), CaCl2 (0.01), FeSO4 (0.01), MnSO4 (0,001), ZnSO4 (0,001), CuSO4 (0,002). Độ pHcủa môi trường được điều chỉnh để 5.5. Sau 14 ngày ấp laccase hoạt động và nồng độ proteindetermined12.2.5. phân tích các phương pháp2.5.1. ngoại bào laccase hoạt động Hoạt động ngoại bào laccase là đo được spectrophotometrically13 với ABTS như là chất nền. Phản ứnghỗn hợp chứa 900 ml 0.1 M natri axetat đệm (pH 5,0) 1 mm ABTS và 0.1 ml men tiêu hóa. Phản ứngđã được giám sát bằng cách đo lường sự thay đổi trong A436 (€ = 2,9 x 104 cm−1 M−1) trong 3 phút. Một trong những đơn vị hoạt động enzym làđịnh nghĩa là số lượng men tiêu hóa ôxi hóa 1  nốt ruồi của ABTS mỗi phút tại 270C. các hoạt động đã được thể hiệntrong U/ml.ISSN: 0975-5462 7134R.Sivakumar et al. / quốc tế các tạp chí khoa học kỹ thuật công nghệTập 2(12), 2010, 7133-71412.5.2. dự toán của proteinProtein conncetration là determined14 bằng cách sử dụng Bio-Rad Protein khảo nghiệm hoá (Bio-Rad) và sử dụngbò huyết thanh albumin (BSA) như là tiêu chuẩn.2.6. tối ưu hóa văn hóa điều kiện laccase sản xuất linh chi SP.Các phương tiện sản xuất được tối ưu cho các tham số cho một khoảng thời gian 14 ngày. Đối với mỗithử nghiệm năm mycelial đĩa (đường kính 6mm) được sử dụng như là inoculum trong 100 mL.2.6.1. thời gian khóa học nghiên cứuĐể tìm ra thời gian tối ưu ấp cho tối đa laccase sản xuất sản xuất 100 mlphương tiện truyền thông đã được chuẩn bị tại Erlenmeyer bình (250 ml) và autoclaved. Vào những năm đĩa (6mm đường kính) 5 ngàyvăn hóa cũ đã được tiêm chủng và ủ tại 270C cho một khoảng thời gian 14 ngày. Các nền văn hóa đã được thu hoạch tại mỗi ngày 2khoảng thời gian. Điều này đã được sử dụng để xác định các hoạt động nội dung và men tiêu hóa protein.2.6.2. ảnh hưởng của pH laccase sản xuất Ảnh hưởng của pH laccase sản xuất được thực hiện bởi ấp văn hóa bình chứa 100 mlsản xuất phương tiện tiêm chủng với năm mycelial đĩa (6 mm) tại các độ pH khác nhau như 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, và 6,5.Các thí nghiệm được tiến hành trong thời gian 14 ngày.2.6.3. tác động của các nguồn carbon laccase sản xuất Tác dụng của các nguồn carbon khác nhau như manitol, lactose, maltose, glucose và Sucroza ngày sản xuấtcủa laccase từ linh chi sp được nghiên cứu. Các nguồn carbon đã được sửa đổi tại nồng độ 2% trong cácsản xuất phương tiện truyền thông. Năm mycelial đĩa (đường kính 6 mm) 5 ngày tuổi văn hóa đã được chuyển giao cho ErlenmeyerBình (250 ml) có chứa 100 ml của phương tiện sản xuất. Bi-đông được ủ tại 270C cho một khoảng thời gian 14 ngày.2.6.4. tác động của các nguồn nitơ laccase sản xuất Để tìm các nguồn nitơ thích hợp cho sản xuất tối đa laccase linh chi SP cáctheo hữu cơ và vô cơ nitơ nguồn cụ thể là natri nitrat, chế phẩm peptone, thịt bò extract, amoni sulfat,và clorua amoni đã được sửa đổi tại nồng độ 0,2%. 5 đĩa mycelial (đường kính 6 mm) 5-văn hóa ngày tuổi được chuyển đến Erlenmeyer bình (250 ml) có chứa 100 ml của phương tiện sản xuất. Bi-đôngđã được ủ tại 270C cho một khoảng thời gian 14 ngày.2.6.5. ảnh hưởng của dung môi vào laccase sản xuất Những ảnh hưởng của dung môi khác nhau như ethanol, methanol, propanol, iso propanol và 2-methyl 1-propanol trênsản xuất laccase từ linh chi sp được nghiên cứu. Các nguồn đã được sửa đổi tại nồng độ 4% trongCác phương tiện sản xuất. Đĩa mycelial (đường kính 6mm) 5 ngày tuổi văn hóa đã được chuyển giao cho ErlenmeyerBình (250ml) có chứa 100 ml của phương tiện sản xuất. Bi-đông được ủ tại 270C cho một khoảng thời gian

Kết quả (Việt) 2:

. Vật liệu
Thuốc thử hóa học lớp thạch đường khoai tây, Czepak DOX agar, tinh bột, chiết xuất men, H2PO4,
Na2HPO4, MgSO4, CaCl2, FeSO4, MnSO4, ZnSO4, CuSO4 được mua từ Hi-Media, Mumbai. Guiacol, ABTS
và CBB G-250 đã được mua từ thương mại SIGMA, Mỹ và được sử dụng cho mục đích phân tích.
2.2. Phân lập nấm căng
Nấm được sử dụng trong nghiên cứu này đã được phân lập từ môi trường sống tự nhiên như mục nát gỗ me trong
vùng lân cận của Kodaikanal, Tamil Nadu, Ấn Độ. Sự căng thẳng được lựa chọn đã được xác định tại Trường Khoa học y tế cơ bản,
Taramani, Chennai là Ganoderma sp. Các nền văn hóa được định kỳ cấy truyền và duy trì trên đường khoai tây
đĩa thạch được trồng ở 270
C và bảo quản ở 40
C.
2.3. Chiếu nấm cho sản xuất laccase
Các nền văn hóa nấm bị cô lập đã được sàng lọc lignolytic enzyme laccase, trên Czapek-DOX agar11. Các
chất nền ABTS (1mm) đã được sửa đổi với các phương tiện cơ bản để màn hình có sự hiện diện của laccase. Đĩa
chứa chất enzyme lignolytic được tiêm một đĩa sợi nấm và ủ ở 270
C trong năm ngày.
Khu oxy hóa xung quanh thuộc địa sợi nấm chỉ ra sự hiện diện của các enzym lignolytic.
2.4. Sản xuất Laccase
Năm đĩa thạch lấy từ biên giới tích cực của các nền văn hóa PDA đã được chuyển giao cho Erlenmeyer bình (250
ml) có chứa 100 ml dung dịch trung tính sau (GL-1): tinh bột (20), chiết xuất nấm men (2.5), H2PO4 (1.0),
Na2HPO4 (0.05), MgSO 4 (0.5), CaCl2 (0.01), FeSO4 (0.01), MnSO4 (0.001), ZnSO4 (0.001), CuSO4 (0,002). Độ pH
của môi trường đã được điều chỉnh đến 5,5. Sau 14 ngày hoạt động laccase ủ bệnh và nồng độ protein là
determined12.
2.5. Phương pháp phân tích
2.5.1. Hoạt động laccase bào
hoạt động laccase ngoại bào được đo spectrophotometrically13 với ABTS như chất nền. Các phản ứng
hỗn hợp chứa 900 ml 1 mM ABTS trong 0,1 M đệm sodium acetate (pH 5,0) và 0,1 ml dung dịch enzyme. Phản ứng
được theo dõi bằng cách đo sự thay đổi trong A436 (€ = 2,9 × 104
cm-1
M-1
) trong 3 phút. Một hoạt động enzyme đơn vị được
định nghĩa là lượng enzyme mà oxy hóa 1  mol ABTS mỗi phút ở 270
C. Các hoạt động được thể hiện
ở U / ml.
ISSN: 0975-5462 7134
R.Sivakumar et al. / Tạp chí Quốc tế Khoa học Kỹ thuật và Công nghệ
Vol. 2 (12), 2010, 7133-7141
2.5.2. Ước tính của protein
Các conncetration protein là determined14 sử dụng Protein Bio-Rad Khảo nghiệm thuốc thử (Bio-Rad) và sử dụng
albumin huyết thanh bò (BSA) như là tiêu chuẩn.
2.6. Tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy để sản xuất laccase của Ganoderma sp.
Các phương tiện sản xuất đã được tối ưu hóa cho các thông số sau một khoảng thời gian 14 ngày. Đối với mỗi
thí nghiệm năm đĩa sợi nấm (đường kính 6mm) được sử dụng như là nguồn bệnh trong 100 mL trung bình.
2.6.1. Thời gian nghiên cứu nhiên
Để tìm ra thời gian tối ưu ủ để sản xuất laccase tối đa sản xuất 100ml
trung bình đã được chuẩn bị trong bình Erlenmeyer (250 ml) và hấp. Để những năm đĩa (6mm đường kính) 5 ngày
văn hóa cũ đã được tiêm và ủ ở 270
C trong thời gian 14 ngày. Các nền văn hóa đã được thu hoạch ở mỗi 2 ngày
khoảng thời gian. Điều này đã được sử dụng để xác định hàm lượng protein và hoạt động của enzyme.
2.6.2. Ảnh hưởng của pH đến sản xuất laccase
Ảnh hưởng của pH đến sản xuất laccase được thực hiện bằng cách ủ các bình nuôi cấy có chứa 100 ml
của trung sản xuất tiêm với năm đĩa sợi nấm (6 mm) ở pH khác nhau như 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, và 6.5.
các thí nghiệm được tiến hành trong thời gian 14 ngày.
2.6.3. Ảnh hưởng của nguồn carbon vào sản xuất laccase
Ảnh hưởng của nguồn carbon khác nhau như manitol, lactose, maltose, glucose và sucrose về sản xuất
của laccase từ Ganoderma sp đã được nghiên cứu. Các nguồn carbon đã được sửa đổi tại các nồng độ 2% trong
trung sản xuất. Năm đĩa sợi nấm (đường kính 6 mm) của văn hóa 5 ngày tuổi đã được chuyển giao cho Erlenmeyer
bình (250 ml) có chứa 100 ml dung dịch vừa sản xuất. Bình được ủ ở 270
C trong thời gian 14 ngày.
2.6.4. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vào sản xuất laccase
Để tìm các nguồn nitơ thích hợp cho việc sản xuất tối đa của laccase của Ganoderma sp các
nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ sau đây cụ thể là natri nitrat, peptone, chiết xuất từ thịt bò, amoni sunfat,
và amoni clorua đã được sửa đổi tại nồng độ 0,2%. Năm đĩa sợi nấm (đường kính 6 mm) 5-
văn hóa ngày tuổi được chuyển giao cho Erlenmeyer bình (250 ml) có chứa 100 ml dung dịch vừa sản xuất. Bình
được ủ ở 270
C trong thời gian 14 ngày.
2.6.5. Ảnh hưởng của dung môi vào sản xuất laccase
Những ảnh hưởng của dung môi khác nhau như ethanol, methanol, propanol, iso propanol và 2-metyl 1-propanol vào
việc sản xuất của laccase từ Ganoderma sp đã được nghiên cứu. Các nguồn tin đã được sửa đổi với nồng độ 4% trong
các phương tiện sản xuất. Các đĩa sợi nấm (đường kính 6mm) của văn hóa 5 ngày tuổi đã được chuyển giao cho Erlenmeyer
bình (250ml) có chứa 100 ml dung dịch vừa sản xuất. Bình được ủ ở 270
C trong một thời gian