HSV-1 quiescency modelThe HSV-2 qui

HSV-1 quiescency model
The HSV-2 quiescency model from Russell et al. [47, 48] was adapted for HSV-1 in MRC5 cells. In short, MRC5-Cas9 cells were seeded in multiple 6-wells plates 3 days prior infection at 210.000 cells/well. After 3 days, the cells were infected with 105k viral HSV-1-eGFP particles/well at 37°C for one hour. The infected MRC5-Cas9 cells were subsequently washed twice with complete medium and incubated in a CO2 incubator at 42°C for 4 days. The culture medium was replaced every day. After 4 days, the cells were returned to regular cell culture conditions (37°C 5% CO2). Next, cells were monitored by fluorescence microscopy for 6 days to exclude wells displaying signs of spontaneously reactivation, which occurred in ± half of the wells. Cells were subsequently harvested and plated at 150,000 cells/well in 12-wells plates. The next day, wells not displaying signs of spontaneous reactivation were transduced with gRNA-carrying lentivirus and selected for after 3 days using puromycin (2μg/ml) for the duration of 3 days. MRC5-Cas9 cells containing quiescent HSV-1-eGFP were counted and 40,000 cells/well (48-well plate) were seeded in triplicate in 48 well plates. The remainder was pelleted and subjected to gDNA isolation using the Quick-gDNA Miniprep kit (Zymo Research, USA). The gDNA was subjected to qPCR to determine the relative HSV-1 genome content. Quiescent MRC5-Cas9 cells were infected the next day with AD169 HCMV (ATCC VR538) to trigger HSV-1-eGFP reactivation. Three days later, cells were harvested, fixed with formaldehyde (1%), and measured by flow cytometry to assess the percentage of eGFP-positive cells as a measure for cells with replicating HSV-1-eGFP.

Kết quả (Việt) 1:

HSV-1 mô hình quiescencyHSV-2 quiescency mô hình từ Russell et al. [47, 48] đã thích nghi với HSV-1 trong các tế bào MRC5. Trong ngắn hạn, tế bào MRC5-Cas9 đã hạt trong nhiều 6 wells tấm 3 ngày trước khi nhiễm trùng tế bào 210.000/tốt. Sau 3 ngày, các tế bào bị nhiễm 105 k virus HSV-1-eGFP hạt/tốt ở 37° C trong một giờ. Các tế bào MRC5-Cas9 bị nhiễm bệnh sau đó rửa sạch hai lần với đầy đủ phương tiện và ủ trong một vườn ươm CO2 tại 42° C trong 4 ngày. Văn hóa vừa được thay thế mỗi ngày. Sau 4 ngày, các tế bào đã quay trở lại điều kiện văn hóa thường xuyên di động (37° C 5% CO2). Tiếp theo, các tế bào đã được giám sát bởi các kính hiển vi huỳnh quang cho 6 ngày để loại trừ các giếng Hiển thị các dấu hiệu kích hoạt một cách tự nhiên, diễn ra tại ± một nửa các giếng. Các tế bào sau đó đã được thu hoạch và mạ lúc 150.000 tế bào/tốt trong 12-wells tấm. Ngày hôm sau, giếng không hiển thị dấu hiệu tự phát kích hoạt đã được transduced với lentivirus gRNA thực hiện và lựa chọn cho sau 3 ngày bằng cách sử dụng puromycin (2μg/ml) trong suốt thời gian 3 ngày. MRC5-Cas9 các tế bào có chứa quiescent HSV-1-eGFP đã được tính và 40.000 tế bào/tốt (48-cũng tấm) hạt trong triplicate trong 48 cũng tấm. Phần còn lại là pelleted và phải chịu sự cô lập gDNA bằng cách sử dụng bộ công cụ Quick-gDNA Miniprep (nghiên cứu Zymo, USA). GDNA đã phải chịu để qPCR để xác định nội dung tương đối gen HSV-1. Quiescent MRC5-Cas9 tế bào bị nhiễm ngày hôm sau với AD169 HCMV (ATCC VR538) để kích hoạt kích hoạt HSV-1-eGFP. Ba ngày sau đó, các tế bào đã được thu hoạch, cố định với formaldehyde (1%) và đo bằng dòng chảy cytometry để đánh giá tỷ lệ tích cực eGFP tế bào như là một biện pháp cho các tế bào với sao chép HSV-1-eGFP.