Figure 2. PCR products of cytochrom

Figure 2. PCR products of cytochrome b gene fragments 359 bp long of samples from different meatballs product separated by 2% high-resolution agarose gel electrophoresis. PCR amplification using cyt b universal primer. (A) M: marker 100 bp DNA ladder (Invitrogen), 1: pork (100%), 2: (beef 75% : pork 25%) 3: (Beef 90% : Pork 10%), 4: (Beef 95% : Pork 5%)5: (Beef 97% : Pork 3%), 6: (Beef 99% : Pork 1%), 7: (Beef 100 %). (B): M: marker 100 bp DNA ladder (Invitrogen), 1: pork (100%), 2: (chicken 75% : pork 25%) 3: (chicken 90% : Pork 10%), 4: (Chicken 95% : Pork 5%)5: (Chicken 97% : Pork 3%), 6: (Chicken 99% : Pork 1%), 7: (Beef 100 %).
Figure 1. Total genomic DNA extracted from beef-pork meatball and chicken-pork meatball. (A) M: marker 100 bp DNA ladder (Invitrogen), 1: pork (100%), 2: (beef 75% : pork 25%) 3: (Beef 90% : Pork 10%), 4: (Beef 95% : Pork 5%)5: (Beef 97% : Pork 3%), 6: (Beef 99% : Pork 1%), 7: (Beef 100 %). (B): M: marker 100 bp DNA ladder (Invitrogen), 1: pork (100%), 2: (chicken 75% : pork 25%) 3: (chicken 90% : Pork 10%), 4: (Chicken 95% : Pork 5%)5: (Chicken 97% : Pork 3%), 6: (Chicken 99% : Pork 1%), 7: (Beef 100 %).
904 Yuny, E., Mohammad, Z. A., Sismindari and Rohman, A. International Food Research Journal 19(3): 901-906
Genomic DNA was applied as a template for the PCR amplification using universal primers. Gene of cytochrome b was selected for the PCR amplification and resulted a DNA fragment of approximately 359 bp (Figure 2). This result indicated that isolated DNA of mixture meatball was enough for PCR amplification. The same result of PCR amplification has also been reported previously (Kocher et al., 1989; Aida et al., 2005; Erwanto et al., 2011). The selection of target gene and primers affecting sensitivity and specification of method for detection. PCR method was very sensitive when primer target represent a gene multicopy of like gene mitochondrial. This research used the area mitochondrial DNA of the cytochrome b as target for detection of porcine.
The PCR reaction allowed fragments of the expected length to be obtained in all meatball samples either beef or chicken mixed with pork, although with various efficiencies. The mitochondrial cytochrome b gene was selected in this study as template for DNA amplification, because it has an acceptable length and an adequate grade of mutation and there are numerous sequences available in the DNA bank databases (Kocher et al., 1989). The mitochondrial primers Cyt b-FW and Cyt b-REV was able to amplify a conserved 359 bp region of the cytochrome b gene of all animal studied, namely chicken, beef and pork.
Sequence DNA of cytochrome b gene of cattle, goat, chicken and pig obtained from database of NCBI was further employed for sequence alignment using software of CLC sequencer. The similarity of the mitochondrial cytochrome b gene among beef, mutton, chicken and pork was 86.64%. As a result of the preliminary CLC sequencer software analysis for the detection of specific restriction sites on pig sequence, a site recognized by BseDI enzyme was cleaved into two fragments, namely 131 bp and 228 bp (Figure 3). Based on RFLP pattern using CLC sequencer, BseDI was applicable to differentiate or identify among four species.
The digestion of PCR products resulted the different fragment sizes, it was 131 and 228 bp at PCR product of porcine. Basically, PCR product of mutton could also be digested, but DNA length size was very short (approximately 5-20 bp), consequently, it could not be seen at 2% agarose gel (Figure 4). A clear band with a length between 100 and 150 bp was observed and thus referable to the 131 bp fragment, as shown in Figure 4 (lane 1). In the same lane, a thicker band can be traced back to the 228 bp fragment.
The data obtained suggests that compared with BsaJI endonuclease profiles, the DNA restriction patterns obtained after digestion of the amplicons with BseDI enzymes consisted of same patterns.
Figure 3. Sequences of nucleotide cytochrome b of Sus scrofa (pig) restriction site by BseDI using CLC Sequencing Software and universal primer position in the fragment of cytochrome b gene (→ dan ←).
Pig species identification in meatballs for Halal authentication 905 International Food Research Journal 19(3): 901-906
The difference between BsaJI and BseDI restriction enzyme is the incubation time for the digestion. BseDI needed 3 h for digestion, while BsaJI enzyme needed more than 12 h (Aida et al., 2005).
PCR amplification of cytochrome b gene followed by digestion by BseDI restriction enzymes was a powerful technique for the identification of pork or other pig derivative products contamination, due to its simplicity and sensitivity. The cytochrome b gene alignment using CLC sequencer software showed that pig intra species have the same restriction sites and their homology was 98.2%.

Kết quả (Việt) 1:

Hình 2. Đảng Cộng sản Romania sản phẩm của cytochrome b gen mảnh 359 bp dài của mẫu từ sản phẩm thịt viên khác nhau cách nhau bằng 2% độ phân giải cao agarose gel điện. Đảng Cộng sản Romania khuếch đại bằng cách sử dụng cyt b phổ quát mồi. (A) M: đánh dấu 100 bp DNA thang (Invitrogen), 1: thịt lợn (100%), 2: (thịt bò 75%: thịt lợn 25%) 3: (thịt bò 90%: thịt lợn 10%), 4: (thịt bò 95%: thịt lợn 5%) 5: (thịt bò 97%: thịt lợn 3%), 6: (thịt bò 99%: thịt lợn 1%), 7: (thịt bò 100%). (B): M: đánh dấu 100 bp DNA thang (Invitrogen), 1: thịt lợn (100%), 2: (gà 75%: thịt lợn 25%) 3: (gà 90%: thịt lợn 10%), 4: (gà 95%: thịt lợn 5%) 5: (gà 97%: thịt lợn 3%), 6: (gà 99%: thịt lợn 1%), 7: (thịt bò 100%).Hình 1. Tất cả DNA gen chiết xuất từ thịt viên bò thịt lợn và thịt lợn gà thịt viên. (A) M: đánh dấu 100 bp DNA thang (Invitrogen), 1: thịt lợn (100%), 2: (thịt bò 75%: thịt lợn 25%) 3: (thịt bò 90%: thịt lợn 10%), 4: (thịt bò 95%: thịt lợn 5%) 5: (thịt bò 97%: thịt lợn 3%), 6: (thịt bò 99%: thịt lợn 1%), 7: (thịt bò 100%). (B): M: đánh dấu 100 bp DNA thang (Invitrogen), 1: thịt lợn (100%), 2: (gà 75%: thịt lợn 25%) 3: (gà 90%: thịt lợn 10%), 4: (gà 95%: thịt lợn 5%) 5: (gà 97%: thịt lợn 3%), 6: (gà 99%: thịt lợn 1%), 7: (thịt bò 100%). 904 Yuny, E., Mohammad, Z. A., Sismindari và Rohman, A. thực phẩm quốc tế nghiên cứu tạp chí 19(3): 901-906 Gen DNA được áp dụng như là một khuôn mẫu để khuếch đại PCR sử dụng chất nền, mồi phổ quát. Gen của cytochrome b được chọn để khuếch đại Đảng Cộng sản Romania và kết quả là một mảnh DNA của khoảng 359 bp (hình 2). Kết quả này chỉ ra rằng ADN bị cô lập của hỗn hợp thịt viên là đủ cho Đảng Cộng sản Romania khuếch đại. Cùng một kết quả của Đảng Cộng sản Romania khuếch đại cũng được báo cáo trước đó (Kocher et al., năm 1989; Aida et al., 2005; Erwanto et al., năm 2011). Việc lựa chọn mục tiêu gen và lớp lót ảnh hưởng đến độ nhạy và đặc điểm kỹ thuật của phương pháp để phát hiện. Phương pháp PCR là rất nhạy cảm khi mục tiêu mồi đại diện cho một multicopy gen của như gen ti thể. Nghiên cứu này sử dụng trong người ADN ti thể tích của cytochrome b như mục tiêu cho các phát hiện của porcine.Phản ứng của Đảng Cộng sản Romania cho phép các mảnh vỡ của chiều dài dự kiến thu được ở tất cả thịt viên mẫu hoặc thịt bò hoặc thịt gà trộn với thịt lợn, mặc dù với hiệu quả khác nhau. Ti thể cytochrome b gen được chọn trong nghiên cứu này làm mẫu cho DNA khuếch đại, vì nó có một chiều dài chấp nhận được và một lớp đầy đủ của đột biến và có rất nhiều trình tự có sẵn trong cơ sở dữ liệu DNA ngân hàng (Kocher và ctv., 1989). Ti thể chất nền, mồi Cyt b-FW và Cyt b-REV đã có thể khuyếch đại một khu vực bảo tồn 359 bp của cytochrome b gen của tất cả các động vật học, cụ thể là thịt gà, thịt bò và thịt lợn.Trình tự DNA của cytochrome b gen của trâu, bò, dê, gà và lợn thu được từ cơ sở dữ liệu của NCBI tiếp tục làm việc cho chuỗi liên kết bằng cách sử dụng phần mềm của CLC sequencer. Sự giống nhau của ti thể cytochrome b gen trong thịt bò, thịt cừu, gà và thịt lợn là 86.64%. Là kết quả của sự sơ bộ CLC sequencer phần mềm phân tích cho phát hiện của các trang web cụ thể hạn chế trên lợn chuỗi, một trang web được công nhận bởi enzym BseDI cảm vào hai mảnh, cụ thể là 131 bp và 228 bp (hình 3). Dựa trên mô hình RFLP sử dụng CLC sequencer, BseDI được áp dụng để phân biệt hoặc xác định một trong bốn loài.Tiêu hóa của Đảng Cộng sản Romania sản phẩm dẫn đến các kích thước khác nhau mảnh, nó đã là bp 131 và 228 PCR sản phẩm của porcine. Về cơ bản, cũng được tiêu hoá PCR sản phẩm của thịt cừu, nhưng kích thước chiều dài DNA là rất ngắn (khoảng 5-20 bp), do đó, nó có thể không được nhìn thấy tại 2% agarose gel (hình 4). Một ban nhạc rõ ràng với chiều dài giữa 100 và 150 bp là quan sát và do đó referable đoạn bp 131, như minh hoạ trong hình 4 (lane 1). Trong làn đường cùng, một ban nhạc dày hơn có thể được ngược trở lại để đoạn bp 228. Dữ liệu thu được gợi ý rằng so với BsaJI endonuclease hồ sơ, các mô hình hạn chế DNA thu được sau khi tiêu hóa amplicons với BseDI enzyme bao gồm của cùng một mô hình. Hình 3. Trình tự của các nucleotide cytochrome b của Sus scrofa (lợn) hạn chế trang web bởi BseDI bằng cách sử dụng phần mềm xác định trình tự CLC và phổ quát mồi vị trí trong các đoạn của cytochrome b gen (→ dan ←). Lợn loài nhận dạng trong thịt viên cho xác thực Halal 905 tạp chí nghiên cứu thực phẩm quốc tế 19(3): 901-906 Sự khác biệt giữa BsaJI và BseDI hạn chế enzyme là thời gian ủ bệnh cho quá trình tiêu hóa. BseDI cần 3 h cho tiêu hóa, trong khi BsaJI enzyme cần thiết hơn 12 h (Aida và ctv., 2005). Đảng Cộng sản Romania khuếch đại của cytochrome b gen theo tiêu hóa bởi enzyme giới hạn BseDI là một kỹ thuật mạnh mẽ cho việc xác định của thịt lợn hoặc ô nhiễm các sản phẩm phái sinh con lợn khác, do của nó đơn giản và nhạy cảm. Cytochrome b gen liên kết bằng cách sử dụng CLC sequencer phần mềm cho thấy rằng con lợn nội loài có các trang web cùng một hạn chế và tính tương đồng của họ là 98,2%.

Kết quả (Việt) 2:

Hình 2. Sản phẩm PCR của các mảnh gene cytochrome b 359 bp dài của mẫu sản phẩm từ thịt viên khác nhau ngăn cách bởi 2% có độ phân giải cao gel agarose điện. Khuếch đại PCR sử dụng sơn lót phổ b cyt. (A) M: đánh dấu 100 bậc thang DNA bp (Invitrogen), 1: thịt lợn (100%), 2: (thịt bò 75%: thịt lợn 25%) 3: (thịt bò 90%: thịt lợn 10%), 4: (Beef 95 %: Thịt lợn 5%) 5: (thịt bò 97%: Thịt lợn 3%), 6: (thịt bò 99%: Thịt lợn 1%), 7: (Bò 100%). (B): M: marker DNA 100 bp thang (Invitrogen), 1: thịt lợn (100%), 2: (gà 75%: thịt lợn 25%) 3: (gà 90%: thịt lợn 10%), 4: (Chicken 95% thịt lợn 5%) 5: (Chicken 97%: Thịt lợn 3%), 6: (Chicken 99%: Thịt lợn 1%), 7:. (Bò 100%)
Hình 1. Tổng DNA chiết xuất từ thịt bò thịt lợn thịt viên và thịt gà thịt lợn thịt viên. (A) M: đánh dấu 100 bậc thang DNA bp (Invitrogen), 1: thịt lợn (100%), 2: (thịt bò 75%: thịt lợn 25%) 3: (thịt bò 90%: thịt lợn 10%), 4: (Beef 95 %: Thịt lợn 5%) 5: (thịt bò 97%: Thịt lợn 3%), 6: (thịt bò 99%: Thịt lợn 1%), 7: (Bò 100%). (B): M: marker DNA 100 bp thang (Invitrogen), 1: thịt lợn (100%), 2: (gà 75%: thịt lợn 25%) 3: (gà 90%: thịt lợn 10%), 4: (Chicken 95% thịt lợn 5%) 5: (Chicken 97%: Thịt lợn 3%), 6: (Chicken 99%: Thịt lợn 1%), 7:. (Bò 100%)
904 Yuny, E., Mohammad, ZA, Sismindari và Rohman, A. International Food Research Journal 19 (3): 901-906
ADN hệ gen được áp dụng như một khuôn mẫu cho việc khuếch đại PCR sử dụng cặp mồi phổ quát. Gene của cytochrome b đã được lựa chọn cho việc khuếch đại PCR và kết quả một đoạn DNA của khoảng 359 bp (Hình 2). Kết quả này chỉ ra rằng DNA riêng biệt của hỗn hợp thịt viên là đủ cho khuếch đại PCR. Cùng một kết quả của sự khuếch đại PCR cũng đã được báo cáo trước đây (Kocher et al, 1989;. Aida et al, 2005;. Erwanto et al, 2011.). Việc lựa chọn các gen mục tiêu và sơn lót ảnh hưởng đến độ nhạy và đặc điểm kỹ thuật của phương pháp để phát hiện. Phương pháp PCR rất nhạy cảm khi mục tiêu đại diện cho một lớp sơn lót multicopy gen của ty thể như gen. Nghiên cứu này sử dụng khu vực DNA ty thể của cytochrome b là mục tiêu cho phát hiện của lợn.
Những đoạn phản ứng PCR cho phép chiều dài dự kiến sẽ thu được trong tất cả các mẫu thịt viên hoặc là thịt bò hoặc thịt gà trộn với thịt lợn, mặc dù có hiệu quả khác nhau. Các gen cytochrome b ti thể được chọn trong nghiên cứu này như là một mẫu cho khuếch đại DNA, bởi vì nó có một chiều dài chấp nhận được và một lớp đầy đủ của đột biến và có nhiều trình tự có sẵn trong cơ sở dữ liệu ngân hàng DNA (Kocher et al., 1989). Các mồi mitochondrial cyt b-FW và cyt b-REV đã có thể khuếch đại được bảo tồn khu vực 359 bp của gen cytochrome b của tất cả các động vật nghiên cứu, cụ thể là thịt gà, thịt bò và thịt lợn.
Trình tự DNA của gen cytochrome b của bò, dê, gà và lợn được lấy từ cơ sở dữ liệu của NCBI đã có việc làm thêm cho chuỗi liên kết sử dụng phần mềm của sequencer CLC. Sự giống nhau của các gen cytochrome b ti thể trong thịt bò, thịt cừu, thịt gà và thịt lợn là 86,64%. Như một kết quả của các phân tích phần mềm sequencer CLC sơ bộ cho việc phát hiện các trang web hạn chế cụ thể về trình tự lợn, một trang web được công nhận bởi enzyme BseDI được cắt thành hai mảnh, cụ thể là 131 bp và 228 bp (Hình 3). Dựa trên mô hình RFLP bằng sequencer CLC, BseDI đã được áp dụng để phân biệt hoặc xác định một trong bốn loài.
Các tiêu hóa của sản phẩm PCR dẫn các kích thước mảnh khác nhau, đó là 131 và 228 bp tại sản phẩm PCR của lợn. Về cơ bản, sản phẩm PCR của thịt cừu cũng có thể được tiêu hóa, nhưng kích thước chiều dài DNA là rất ngắn (khoảng 5-20 bp), do đó, nó có thể không được nhìn thấy ở 2% gel agarose (Hình 4). Một ban nhạc rõ ràng với một chiều dài từ 100 đến 150 bp được quan sát và do đó referable đến đoạn 131 bp, như thể hiện trong hình 4 (ngõ 1). Trong cùng làn đường, một ban nhạc dày hơn có thể được truy trở lại đoạn 228 bp.
Các dữ liệu thu được cho thấy rằng so với BsaJI profile endonuclease, các mô hình hạn chế DNA thu được sau khi tiêu hóa của amplicon với enzyme BseDI gồm mô hình tương tự.
Hình 3. trình tự nucleotide của cytochrome b của Sus scrofa (lợn) trang web hạn chế bởi BseDI sử dụng CLC Sequencing Phần mềm và vị trí mồi phổ quát trong đoạn gen cytochrome b (→ dan ←).
nhận dạng các loài lợn trong thịt viên để xác thực Halal 905 Nghiên cứu Thực phẩm quốc tế Tạp chí 19 (3): 901-906
Sự khác biệt giữa BsaJI và BseDI enzyme hạn chế là thời gian ủ bệnh cho tiêu hóa. BseDI cần 3 h cho tiêu hóa, trong khi enzyme BsaJI cần hơn 12 h (Aida et al., 2005).
khuếch đại PCR của gen cytochrome b và tiếp theo tiêu hóa bởi các enzyme hạn chế BseDI được một kỹ thuật mạnh mẽ cho việc xác thịt lợn hoặc hàm lợn khác sản phẩm ô nhiễm, do sự đơn giản và tính nhạy cảm của nó. Các liên kết gen cytochrome b sử dụng phần mềm sequencer CLC cho thấy rằng loài lợn nội có các trang web hạn chế tương tự và tương đồng của họ là 98,2%.